ÖZET

Amaç: Deneysel katarakt modelinde sesamolün potansiyel koruyucu etkilerini araştırmaktır. Gereç ve Yöntem: Yirmi bir adet Spraque Dawley cinsi sıçan yavrusu rastgele bir şekilde her birinde 7 sıçan bulunan üç gruba ayrıldı. Kontrol grubu dışındaki tüm sıçanlara deneysel katarakt oluşturmak için doğumdan sonraki 9. günde subkutan sodyum selenit enjekte edildi. Onuncu ve 14. günler arasında sham grubundaki sıçanlara intraperitoneal 50 mg/kg/gün salin solüsyonu uygulanırken sesamol grubunda aynı yolla 50 mg/kg/gün sesamol verildi. Katarakt evrelemeleri yapıldıktan sonra lensler kapsülleriyle birlikte çıkarıldı ve lens süpernatantlarında ortalama indirgenmiş glutatyon (GSH), malondialdehit (MDA), toplam antioksidan seviyesi (TAS) ve toplam oksidan seviyesi (TOS) biyokimyasal olarak analiz edildi. Bulgular: Kontrol grubu herhangi bir katarakt gelişimi göstermedi. Ortalama GSH ve TAS seviyesi sesamol grubunda sham grubundakinden anlamlı derecede daha yüksek bulundu (p<0,05). Ortalama katarakt gelişimi evresi, MDA ve TOS seviyeleri sesamol grubunda sham grubundakine göre anlamlı derecede düşük bulundu (p<0,05). Sonuç: Çalışmamız sesamolün lenste TOS ve MDA seviyelerini düşürürken TAS ve GSH seviyelerini artırdığını ve katarakt oluşumunu önlediğini göstermektedir.

Giriş

Katarakt, lensin şeffaflığının kaybolması veya bulanıklaşmasıdır ve görmenin azalmasına neden olur.¹ Katarakt, en sık yaşlanmaya bağlı olarak ortaya çıksa da travma, enflamasyon, kalıtım, radyasyona maruz kalma, metabolik hastalıklar, yetersiz beslenme ve diğer oküler patolojilerinden kaynaklanan komplikasyonlar nedeniyle de gelişebilir.^1,2 Katarakt için risk faktörleri arasında diyabet, sigara içiciliği, uzun süre güneş ışığına maruz kalma, alkol kullanımı nedeniyle lenste oksidatif hasar, bozulmuş glukoz metabolizması, radyasyon hasarı ve toksik hasar bulunmaktadır. Yaşa bağlı kataraktın kesin patojenik mekanizması bilinmemektedir. Bununla birlikte lenste serbest oksijen radikallerinin artması, antioksidan enzimlerin azalması ve elektrolit dengesinin bozulmasının katarakt gelişiminde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Güneş gözlüğü kullanmak ve sigara içmemek katarakt gelişmesini, tamamen önleyemese bile, yavaşlatabilir.^3,4

Günümüzde, kataraktın tek etkin tedavisi katarakt cerrahisidir. Kataraktlı lens cerrahi olarak çıkartılarak, yerine yapay göz içi lens implantasyonu yapılır.^1,2,3 İki bin yirmi yılında katarakt nedeniyle görme engelli olan 10 milyon kişiye katarakt ameliyatı yapılacağı tahmin edilmektedir.⁵ Katarakt tedavisi ile ilişkili poliklinik, yatan hasta ve reçeteli ilaç hizmetlerinin toplam yıllık tıbbi maliyetinin 6,8 milyar $ olduğu hesaplanmaktadır.⁶ Katarakt başlangıcı on yıl kadar geciktirilebilirse, yıllık katarakt cerrahisi sayısının %45’e kadar azalacağı düşünülmektedir.⁷

Katarakt gelişimesinde ve ilerlemesindeki ana mekanizma oksidatif strestir.⁸ Oksidatif stres teorisine göre serbest oksijen radikalleri, lens proteinlerinin çapraz bağlanması ve agregasyonu, membran lipit peroksidasyonu, epitel hücre apoptozisi ve lense hasar veren bazı biyokimyasal reaksiyonlar ile katarakt oluşumuna neden olur.⁹ Lenste oksidan hasara karşı bazı önleyici bileşikler bulunmasına karşın, katarakt oluşumunu engellemeye yetecek düzeyde değildirler. Özellikle A, C ve E vitamini gibi antioksidanlar serbest radikalleri azaltarak ve süpürücü etki yaparak oksidatif hasara karşı lens üzerinde potansiyel koruyucu bir etkiye sahiptir. Önceki araştırmalardan elde edilen bilgiler, yüksek miktarda antioksidan alınması ve serum antioksidan düzeylerinin yüksek olmasının katarakt oluşumundan koruyucu etkiye sahip olduğunu göstermektedir.¹⁰

Sesamol (3,4-metilendioksifenol), Sesamum türlerinden elde edilen susam yağında bulunan iyi bilinen ve güçlü bir antioksidan bileşiktir. Sesamolün güçlü antioksidan etkisinin yanı sıra çeşitli önemli biyolojik etkileri vardır. Bunlar arasında kanser hücreleri ve kardiyovasküler hücrelerde büyümenin durdurulması ve apoptozun indüksiyonu, vasküler fibrinolitik kapasitenin arttırılması, kimyasal önlem, antimutagenik ve antihepatotoksik aktiviteler sayılabilir.¹¹

Bildiğimiz kadarıyla literatürde sesamolün katarakt gelişimini önleyici etkisinin araştırıldığı herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada, deneysel sodyum selenit katarakt modelinde sesamolün katarakt gelişimine olası koruyucu etkisini araştırmayı amaçladık.

Gereç ve Yöntem

Çalışma Tasarımı ve Etik

Bu çalışma, biyokimya anabilim dalının katkısı ile Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı’nda gerçekleştirildi. Fırat Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri kapsamında desteklendi. Çalışma boyunca, sıçanlar üniversitemizin deneysel araştırma merkezinde tutuldu. Sıçanlar, özel tel tabanlı kafeslerde ve standart koşullarda (12 saat gün ışığı-karanlık döngüsü, havalandırma, sabit oda sıcaklığı) barındırıldı. Tüm sıçanlar postnatal 21. güne kadar sadece anne sütü ile beslendi ve 21. günde dekapite edildi. Üniversitenin yerel etik kurulundan onay alındı ve çalışma her hayvanın bir gözü kullanılarak yapıldı. Tüm işlemler hayvan bakımı ve deneyleri için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Bilimsel Kuruluşlarda Sıçanların Bakım Rehberi tarafından belirlenen kurallara bağlı kalarak gerçekleştirildi.

Çalışma Grupları

Sıçanlar, her grupta 7 sıçan olacak şekilde rastgele üç gruba ayrıldı.

Katarakt gelişimini sağlamak için kontrol grubunun dışındaki tüm yenidoğan sıçanlara postnatal 10. günde tek doz gram vücut ağırlığı başına 30 nmol subkutan sodyum selenit (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, ABD) enjeksiyonu yapıldı. Kontrol grubundaki sıçanlara herhangi bir tedavi verilmedi. Onuncu ve on dördüncü günler arasında; sham ve sesamol grubundaki sıçanlara sırasıyla intraperitoneal 50 mg/kg/gün salin veya 50 mg/kg/gün sesamol enjeksiyonu yapıldı. Postnatal üçüncü haftanın sonunda katarakt oluşumu biyomikroskopik muayene ile değerlendirildi. Biyomikroskop ile muayenesinden önce, pupil dilatasyonu için iki saat boyunca her 30 dakikada bir %0,5 tropikamid (Tropamid; Bilim, İstanbul, Türkiye) ve %2,5 fenilefrin hidroklorid damla (Mydfrin; Alcon, Hunenberg, İsviçre) damlatıldı. Tüm lensler değerlendirilerek morfolojik olarak katarakt gelişimi açısından evrelendi (Resim 1, 2, 3, 4, 5, 6). Lens fotoğrafları x25 büyütmede, biyomikroskopa takılı kamera (Topcon, Tokyo, Japonya) kullanılarak çekildi.

Yirmi birinci günde sıçanlar anestezi altında dekapite edildikten sonra, gözler enüklee edildi ve lensler kapsülleri ile birlikte çıkartıldı. Dondurulan lens örnekleri tartıldı ve buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin çözeltisi (0,01 M, pH 7,4) içinde homojenize edildi. Homojenizasyon işlemi, +4 °C’de Bullet Blend Doku Homojenizatör (Next Advanced Inc, Averill Park, NY, ABD) kullanılarak üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirildi. Elde edilen homojenatlar 4 °C’de 10.000 g’de 30 dakika santrifüj edildi ve süpernatanlar toplandı. Malondialdehit (MDA), glutatyon (GSH), toplam antioksidan seviyesi (TAS) ve toplam oksidan seviyesi (TOS) ölçümlerinde süpernatanlar kullanıldı.

Anestezi Tekniği

Anestezi indüksiyonu ve analjezi için intramüsküler 50 mg/kg ketamin hidroklorür (Ketalar, Eczacıbaşı Holding Co, İstanbul, Türkiye) ve 6 mg/kg xylazin hidroklorid (Rompun^®; Bayer, Türkiye) kombinasyonu kullanıldı. Cerrahi işleme başlamadan önce, her hayvanın iki gözüne tek bir damla %1 proparakain hidroklorür (Alcaine, Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX, ABD) damlatıldı.

Katarakt Değerlendirilmesi ve Evrelemesi

Katarakt gelişimi üç hafta boyunca her hafta biyomikroskop ile değerlendirildi. Katarakt, tekli yazar (I.E.) tarafından Hiraoka ve Clark sınıflamasına uygun şekilde biyomikroskop görüntülerine göre evrelendi.¹² Bu sınıflandırma aşağıdaki gibidir:

Evre 0: Normal saydam lens,

Evre 1: Başlangıç arka subkapsüler opasite veya minimal nükleer opasite,

Evre 2: Fibrilleri şişmiş hafif nükleer opasite veya seyrek arka subkapsüler opasite,

Evre 3: Kortikal yayılımlı diffüz nükleer opasite,

Evre 4: Parsiyel nükleer opasite,

Evre 5: Lens korteksini tutmayan nükleer opasite,

Evre 6: Tüm lensi tutan olgun katarakt.

Lens fotoğrafları, biyomikroskoba bağlı dijital bir kamera (CCDIRIS, model DXC 107 AP, Sony Corp.) kullanılarak x25 büyütmede çekilmiştir.

Lenslerdeki MDA, GSH, TAS ve TOS düzeylerinin analizi:

- Lipit peroksidasyonunun göstergesi olan MDA düzeyi, yüksek a sıvı kromatografisi (HPLC) ile MDA ölçüm kiti (Immuchrom GmbH, Hessen, Almanya) kullanılarak analiz edildi. İlk önce, proteine bağlı malondialdehid hidrolize edildi ve floresan bir ürüne dönüştürüldü (95 °C’de 60 dakika). Floresan ürün daha sonra soğutuldu (2-8 °C), santrifüj edildi, reaksiyon solüsyonuyla karıştırıldı ve HPLC sistemine enjekte edildi. MDA tarafından üretilen floresans, spektroflorometreli izokratik HPLC sisteminde 553 nm (emisyon) ve 515 nm (uyarma) dalga boylarında ölçülmüştür. Sonuçlar nanomol/mililitre cinsinden ifade edildi.

- İndirgenmiş GSH ölçümleri GSH kiti (Immuchrom GmbH, Hessen, Almanya) kullanılarak HPLC ile gerçekleştirildi. Derivatizasyon reaksiyonu esnasında GSH bir floresan proba dönüştürüldü. Presipitasyon ile yüksek molekül ağırlıklı maddeler uzaklaştırıldı. Santrifüjden sonra floresan prob soğutuldu (2-8 °C) ve 20 µL örnek HPLC sistemine enjekte edildi. Ölçümler, floresan dedektörlü bir HPLC sistemi ile 385 nm’de (eksitasyon) ve 515 nm (emisyon) dalga boyunda yapıldı. Sonuçlar mikromol/litre cinsinden ifade edildi.

- TAS ve TOS düzeyleri, bir otoanalizör (Siemens Advice 2400 Chemistry System, Japonya) ile ticari kitlerle (Relassay, Gaziantep, Türkiye) otomatik kolorimetrik ölçüm yöntemi kullanılarak ölçüldü. TAS ölçüm yöntemi, 2,2’-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sülfonik asit) (ABTS) molekülünün hidrojen peroksit varlığında ABTS+ molekülüne oksidasyonu prensibine dayanmaktadır. Reaksiyon hızı, bir vitamin E analoğu olan Troloks standart metodu ile kalibre edildi ve mmol Troloks eşdeğeri/L olarak ifade edildi.

- TOS ölçümü, örnekte bulunan oksidanlar tarafından ferröz iyon-o-dianisidin kompleksinin ferrik iyona oksidasyonu prensibine dayanır. Renk yoğunluğu, örnekteki oksidan miktarı ile orantılıdır. Spektrofotometrik test hidrojen peroksit ile kalibre edildi ve sonuçlar litre başına mikromolar hidrojen peroksit eşdeğeri cinsinden ifade edildi (µmol H₂O₂ eşdeğeri/L).

İstatiksel Analiz

Gruplar arasındaki farkları belirlemek için istatistiksel analizler SPSS 22.0 paket yazılımı (IBM SPSS Statistics) yazılımı (v 22; IBM Corporation, Armonk, NY, ABD) kullanılarak yapıldı.Tüm veriler ortalama ± standart deviasyon olarak bildirildi. Normallik testi her değişken için yapıldı. Normal dağılıma uyan parametrik veriler için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi kullanıldı. Gruplar, değişkenlerin özelliklerine göre Mann-Whitney U testi, Kruskal-Wallis testi ve ANOVA ile karşılaştırıldı. P değerinin 0,05’ten küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular

Katarakt Evreleri

Çalışma gruplarının ortalama katarakt evreleri Tablo 1’de gösterilmektedir. Kontrol grubunda katarakt oluşumu izlenmedi. Sham ve sesamol gruplarında ortalama katarakt evreleri sırasıyla 3,50±1,41 ve 0,57±1,01 idi. Sham grubunda ortalama katarakt evresi kontrol grubundan anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0,05). Sesamol grubunda ortalama katarakt evresi sham grubundan anlamlı olarak daha düşüktü (p<0,05).

MDA, GSH, TAS ve TOS Düzeyleri

Çalışma gruplarındaki ortalama MDA, GSH, TAS ve TOS düzeyleri Tablo 1’de gösterilmektedir.

Kontrol, sham ve sesamol grubundaki ortalama MDA düzeyleri sırasıyla 4,0±0,46, 12±0,87 ve 8±0,51 mmol/L olarak ölçüldü. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, sham grubu lipit preoksidasyonunun bir belirteci olan MDA’nın anlamlı derecede yüksek seviyelerine sahip olduğu saptandı (p<0,05). Sesamol grubunda sham grubundan anlamlı derecede daha düşük MDA seviyeleri (p<0,05) ve kontrol grubundan anlamlı derecede daha yüksek MDA seviyeleri (p<0,05) olduğu gözlendi.

Kontrol, sham ve sesamol grubundaki lenslerden elde edilen ortalama GSH düzeyleri sırasıyla 13±0,90, 6,0±0,15 ve 12±0,93 µmol/L olarak ölçüldü. Ortalama GSH seviyesi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında sham grubunda anlamlı derecede düşüktü (p<0,05). Sesamol grubunun ortalama GSH seviyesi sham grubundakinden anlamlı derecede daha yüksekti (p<0,05). Sesamol grubundaki ortalama GSH seviyesinin kontrol grubundakinden anlamlı derecede farklı olmadığı gözlendi (p>0,05).

Kontrol, sham ve sesamol gruplarının ortalama TOS değerleri sırasıyla 121±0,99; 177±0,18 ve 148,0±0,22 µmol H₂O₂ eşdeğeri/L idi. Ortalama TOS sham grubunda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha yüksek bulundu (p<0,05). Sesamol grubundaki ortalama TOS sham grubundakinden anlamlı derecede daha düşüktü (p<0,05). Sesamol grubundaki ortalama TOS’nin kontrol grubundakinden anlamlı derecede daha yüksek olduğu gözlendi (p<0,05).

Kontrol, sham ve sesamol grubunda ortalama TAS düzeyi sırasıyla 6,75±0,97; 3,09±0,50 ve 3,86±0,90 mmol Troloks Equiv./L idi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hem sham hem sesamol gruplarında ortalama TAS düzeyleri anlamlı derecede daha düşük bulundu (sırasıyla p<0,001 ve p<0,05). Sesamol grubundaki ortalama TAS sham grubundakinden anlamlı derecede daha yüksek değildi (p>0,05).

Tartışma

Vitaminler, karotenoidler, kafein ve flavonoidler gibi katarakt gelişimini baskılayan veya geciktiren bileşikler bulunmasına karşın, bu bileşikler katarakt oluşumunu tamamen engelleyecek kadar güçlü değildir.^6,13,14

Katarakt oluşumunu deneysel olarak tetiklemek için radyasyon, galaktoz, streptozosin ve selenit gibi çeşitli ajanlar kullanılabilir.¹⁵ Bununla birlikte, selenit tarafından indüklenen katarakt pek çok açıdan insanlarda görülen kataraktlara benzer olduğu için selenit modelini kullanmayı tercih ettik. Selenit, ilk olarak Ostadova ve ark.¹⁶ tarafından kullanılmıştır ve şu anda deneysel katarakt modellerinde en çok kullanılan farmakolojik ajanlardan biridir. Selenit, kristalin lenste oksidatif hasar ve lipit peroksidasyonu, hidrojen peroksit oluşumu ve indirgenmiş GSH konsantrasyonunda azalmaya sebep olarak katarakt oluşumuna neden olur.^15,16

Sesamol (3,4-metilendioksifenol), susam yağında bulunan en önemli antioksidan bileşiktir. Sesamol güçlü antioksidan aktivitesinin yanı sıra kanser hücrelerinde ve kardiyovasküler hücrelerde büyümenin durması ve apoptozun indüksiyonu, vasküler fibrinolitik kapasitenin güçlendirilmesi ve kimyasal önlemeyi içeren çok sayıda önemli biyolojik aktivitede rol oynar ve radyasyondan koruma, gastroproteksiyon, nöroproteksiyon ve miyokardial koruma gibi sitoprotektif özelliklere sahiptir. Ayrıca antimutagenik, antihepatotoksik, antitrombositik, yaşlanmayı önleyici ve anti-enflamatuvar etkilere de sahiptir.^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28}

Sesamol, hidroksil radikallerinin üretimini ve lipit peroksidasyonunu güçlü ve belirgin olarak azaltır. Sesamolün glial astrositlerde monoamin oksidaz (MAO) aktivitesini ve nitrit oksit ve hidrojen peroksit üretimini azalttığı bulunmuştur.^{11,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28} Bu nedenle serebral iskemiye karşı nöroprotektif etkilere sahiptir.²⁹ MAO, beyinde serotonin, dopamin ve norepinefrin gibi belirli aminleri katabolize eden bir enzimdir. Bu nedenle, sesamolün Alzheimer hastalığı ve inme gibi yaşa bağlı nörodejeneratif bozukluklarda koruyucu bir rol oynayabileceği öne sürülmüştür.³⁰ Yakın tarihli bir çalışmada, sesamolün lipit peroksidasyonunu azaltarak deneysel diyabetik nefropatiye karşı koruyucu bir etki yaptığı bildirilmiştir.²¹

Lens epiteli tarafından sentezlenen GSH, veya L-g-glutamil-L-sisteinil-glisin, lensin oksidatif hasardan korunmasında son derece önemli bir rol oynamaktadır. Hücre içi GSH seviyesi, GSH sentetaz, GSH peroksidaz ve GSH redüktazdan oluşan bir enzim kompleksi tarafından düzenlenir.^31,32 Ayrıca, GSH sentezindeki temel işlevsel enzimler olan nikotinamid adenin dinükleotit fosfat oksidaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz, oksidatif maddeleri süpürücü etki ile senil katarakt oluşumunu yavaşlatır.³³ Pek çok çalışma, GSH düzeylerinin kataraktlı lenslerde yüksek, ancak normal lenslerde düşük olduğunu göstermiştir. Böylece, intraselüler GSH seviyesinin yükselmesi lipit peroksidasyonuna ve serbest radikaller ile bir çok hücresel sistemin hasar görmesine neden olur.^32,33

MDA, hücrelerde lipit oksidasyonu sonucu üretilen ana metabolittir ve DNA ile proteinlerin çapraz bağlanmasına neden olarak işlevselliğini ve aktivitesini değiştirebilir. Membran fosfolipitleri ve düşük dansiteli lipoprotein, serbest radikallerin etkilerine en duyarlı makromoleküllerdir.³⁴ Doymamış yağ asitlerinde lipit peroksidasyonuna bağlı olarak çift bağların oksidasyonu, membran geçirgenliği, membran akışkanlığı ve salınım işlevinde bozulmaya neden olur.³⁵

Plazmada bilirubin, serbest demiri taşıyan transferrin, seruloplasmin, ürik asit, vitamin E, vitamin C ve proteinler gibi birçok antioksidan bulunur ve bunları vücuda dağıtmak kanın önemli bir fonksiyonudur. TAS plazmadaki en önemli göstergedir. Plazmadaki antioksidanlar sürekli etkileşir ve birbirlerinin etkilerini güçlendirir. Ayrıca, bir antioksidan maddede azalma, diğerlerinde artış ile telafi edilebilir. TAS ölçümü, tek tek antioksidan maddelerin ölçümlerinden elde edilenden daha değerli bir bilgi sağlar. Bu nedenle, tek tek antioksidan düzeyleri yerine antioksidan durumu belirlemek için toplam antioksidan kapasitesi ölçülmektedir.^35,36

Sonuç

PubMed veritabanını araştırarak yaptığımız literatür incelemesine dayanarak, daha önce deneysel katarakt modelinde katarakt gelişiminin önlenmesinde sesamol kullanımını etkileri araştırılmamıştır. Bu nedenle, çalışmamız bu konuda yapılan ilk araştırmadır. Çalışmamızda elde edilen düşük TOS ve MDA değerleri ile yüksek TAS ve GSH değerleri, sesamolün antioksidan etkilerinin katarakt oluşumunu engelleyebileceğini düşündürmektedir. İnsanlarda bu ajanların potansiyel antioksidan etkilerini belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Etik

Etik Kurul Onayı: Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu, 12/03/2014 tarih ve 67 numaralı etik kurul onayı.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan, Dizayn: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan, Veri Toplama veya İşleme: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan, Analiz veya Yorumlama: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan. Literatür Arama: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan, Yazan: Burak Turgut, İrfan Ergen, Nevin İlhan.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.