ÖZET

Amaç:

Descemet membran (DM) greft rulo formasyonunun açılma zamanının çeşitli sıvı sıcaklıklarında değişim gösterip göstermediğini araştırmaktır.

Gereç ve Yöntem:

Çalışma prospektif, ex vivo ve deneyseldir. Çalışma Haziran 2014 - Haziran 2015 tarihleri arasında Adana Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi’nde kornea bölümünde üçüncü basamakta yürütülmüştür. DM’ler başlangıçta aldığı rulo formasyonu sıkılığına göre 4 kategoriye ayrılmış ve dört farklı BSS sıcaklığı (8, 16, 23 ve 36 °C) kullanılarak dört farklı grupta yürütülmüştür. Çalışmada kullanılan 16 donör kornea hastanenin göz bankasından elde edilmiştir.

Bulgular:

Hazırlanan DM rulo oluşumları, alınan verici korneanın durumuna göre değişebilir. Bazıları sıkı bir rulo oluştururken bazıları daha açık rulo oluşturabilir. Tüm gruplarda, 5. ve 10. dakikalarda farklı dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) sıcaklıklarına konan DM rulolarında herhangi bir fark gözlenmemiştir. Tüm gruplarda, DM rulo oluşumlarında sıkılaşma veya açılma gözlenmemiştir.

Sonuç:

Bu çalışmada farklı BSS sıcaklıklarının, açılma zamanı üzerinde herhangi bir etkisinin olmadığı bulunmuştur.

Giriş

Descemet membran endotelyal keratoplasti (DMEK) ilk olarak Melles ve ark.^1,2 tarafından hastalıklı endotel ve descement membranının (DM), bağlı olduğu kornea stromasından uzaklaştırılarak izole edilen donör endotel DM tabakası kullanılarak replasmanı olarak tanımlanmıştır. Descemet soymalı otomatik endotelyal keratoplasti (DSAEK) prosedürü iyi standardize ve tekrarlanabilir greft hazırlama ve açma yöntemi olsa da DMEK halen zorluklar içermektedir. Grefti posterior stromaya bağlamak için lamelin açıldığı prosedürün ana adımı özellikle zor olabilir. Greft manipülasyonlarının çoğu bu basamakta yapılmaktadır.³

DMEK, DSAEK’ya göre daha hızlı ve daha eksiksiz bir görme rehabilitasyonu sağlar.^4,5,6 Ancak, greft hazırlanması ve açılması adımları daha az standartlaşmıştır. DMEK’de greft hazırlama fazı, DM’nin ön kamaraya enjeksiyonu ve ön kamarada gerçekleşen tüm açılma aşamaları sıvı bir ortamda gerçekleştirilir. Sıvı ortam sıcaklığının greft açılmasını etkilenebileceğini varsaydık.

Bazı hastaların DMEK ameliyatlarını sırasında açılması zor olan sıkı DM rulolarının spontan olarak açıldığını gözlemledik ve bunun mikroskop ışığından kaynaklanan ısınmaya bağlı olabileceğini düşündük. DMEK ameliyatı uzarsa, mikroskop ışığının termal etkisi olabilir. DM’deki ana protein tip IV kollajendir. Isı ile meydana gelen güçlü osilasyonlar moleküller arasındaki bağları kırarak kollajen yapısında bozulmaya neden olur ve bu da DM açılma süresini etkileyebilir.⁷ Sıcaklık değişiminin DM rulo sıkılığını etkileyebileceğini gösteren hiçbir hayvan modeli veya çalışma bulunmadığından, laboratuvar koşullarında normal vücut sıcaklığına kadar sıcaklıkların DM ruloları üzerindeki etkisini araştırdık.

Bu deneysel çalışmada, pozitif seroloji nedeniyle kullanılamayacak olan kornea DMEK greftlerin çeşitli sıvı sıcaklıklarında açılma süresinin değişip değişmediği araştırıldı.

Gereç ve Yöntem

Bu çalışma prospektif, ex vivo ve deneysel olarak planlandı. Etik onay çalışmanın yapıldığı Adana Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi’nden alındı. Çalışma Haziran 2014 - Haziran 2015 tarihleri arasında kornea hastalıkları için bir tersiyer merkez olan Adana Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Göz Bankası’ndan alınan 16 donör kornea kullanılarak gerçekleştirildi. Donörlerin yaşları kaydedildi. Donör kornealar, serolojik testler (HbsAg⁺ veya antiHCV⁺) pozitif sonuç verdiği için implantasyona uygun değildi.

Korneoskleral doku eksize edildi ve 14 gün süre ile 4 °C’de Eusol-C (AlchimiA, Viale Avusturya, İtalya) içeren bir kornea saklama kabında saklandı. DM dokularında biyomikroskobik inceleme ile endotel patolojisi olmadığı görüldü (korneal endotelyal distrofi ya da katlantı bulgusu ve intraoküler cerrahi öyküsü yoktu). Ölümden sonra doku soğuk ortamda korunmaya alınmadan önce geçen süre 12 saatten kısaydı ve doku çıkartıldıktan sonra 7 gün içinde kullanıldı.

Donör Hazırlığı

Tüm dokular ameliyathanede, daha önce tarif edilen şekilde, değerlendirmeden hemen önce daldırılmış kornea tekniği kullanılarak tek bir cerrah (Y.K.) tarafından hazırlandı.⁸ Korneoskleral doku, DM hazırlanması sırasında kaymayı önlemek için Barron vakumlu panç (Katena Products, Inc., New Jersey, ABD) üzerine yerleştirildi. Tüm DM greftlere, DMEK cerrahisinde en çok tercih edilen çaplardan biri olan 8,0 mm’lik panç ile yüzeysel trefinasyon yapıldı. DM kenarları %0,06 tripan mavisi solüsyonu ile boyandı ve donör rim 23 °C dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) ile dolduruldu. Soyma işlemi bu ortam içinde, kenardan merkeze doğru, bağlama pensi kullanılarak gerçekleştirildi ve DM çıkartıldı. DM rulosu daha sonra 60 saniye boyunca tripan mavisi ile yeniden boyandı (Resim 1).

DM Ruloları

DM greftleri rulonun ilk sıkılık derecesine göre 4 kategoriye ayrıldı. Buna göre 1/4 DM rulo çok sıkıydı (yaklaşık 1-2 mm genişlikte), 2/4 DM rulo yaklaşık 3-4 mm genişlikte, 3/4 DM rulo yaklaşık 5-6 mm genişliğinde ve 4/4 DM rulo neredeyse tamamen açıktı (yaklaşık 7-8 mm genişliğinde).

Bağlama forsepsi kullanılarak hazırlanan DM ruloları, farklı sıcaklıklarda BSS içeren kapalı cam kaplara yerleştirildi. DM rulolarının yapı ve boyutlarındaki değişiklikler, başlangıçta, 5. ve 10. dakikada oftalmik cerrahi mikroskop ile gözlendi ve fotoğraflandı.

Ameliyathanenin ve odada bulunan sıvıların (göreceli olarak) sıcaklığı, ameliyat sırasında 22 ila 24 °C arasında değişebilir.⁹ Mevcut çalışmanın yapıldığı ameliyathanede ortam sıcaklığı ~23 °C idi. Bir başka çalışmada, ön kamarada ortalama sıcaklığın 23,6 °C olduğu saptanmıştır.¹⁰ Bu nedenle, 23 °C DM grefti soyulurken kullanılacak BSS sıcaklığı için mantıklı bir değerdir. Bu çalışma için 8 °C (4-8 °C arasında donör dokusunun saklanma sıcaklığıdır) ile 36 °C (insan vücudu sıcaklığı) arasındaki sıcaklık aralığı dikkate alındığında, DM greftleri için optimal BSS sıcaklığını belirlemek için 8, 16, 23 ve 36 °C’lik sıcaklıkları değerlendirdik.

Çalışma dört farklı BSS sıcaklığının kullanıldığı dört farklı grup ile gerçekleştirildi. Buna göre 3 (%20,0) DM grefti 8 °C BSS (Grup 1), 4 greft (%26,7) 16 °C BSS (Grup 2), 4 greft (%26,7) 23 °C BSS (Grup 3) ve 4 greft ise 36 °C BSS içine (%26,7) (Grup 4) kondu. Tüm gruplardaki BSS sıcaklıkları bir termometre ile kontrol edildi ve 10 dakikalık gözlem süresi boyunca sabit tutuldu. Farklı sıcaklıklardaki BSS içinde DM greftlerinin katlanma sıkılıkları 10 dakika boyunca gözlendi. DMEK cerrahisinde endotel kaybının azaltılması ve iyi postoperatif prognoz sağlanması için DM grefti açılma zamanının kısa olması istenmektedir. Bu nedenle bu çalışmada, BSS sıcaklığının DM greftlerinin 10 dakika içince açılma süresine olan etkisi gözlendi ve kaydedildi.

İstatistiksel Analiz

Verilerin analizinde SPSS sürüm 16.0 yazılımı (SPSS, Inc., Chicago, IL) kullanıldı. Analizde parametrik olmayan testler kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler medyan ve aralık veya ortalama ± standart sapma (SD) olarak verildi. Oranların dağılımı ki-kare dağılımı kullanılarak analiz edildi. P değerinin 0,05’in altında olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular

Medyan donör yaşı (8 donörün 16 korneası) 69 yıl (aralık, 65-71 yıl) idi. Erkek/kadın oranı 6 (%37,5)/10 (%62,5) idi. Gruplar arasında yaş ve cinsiyet açısından anlamlı bir fark yoktu (sırasıyla, p=0,114, p=0,362).

Ölümden sonra kornea çıkarılmasına kadar geçen medyan süre 7 saat (aralık, 5-9 saat) iken, cerrahiye kadar geçen medyan saklama süresi 5,5 gündü (aralık, 5-7 gün). Gruplar arasında ölümden kornea çıkarılmasına veya ameliyattan önce saklama süresi açısından istatistiksel anlamlı fark yoktu (sırasıyla p=0,687, p=0,887).

Ölüm nedeni 3 donörde serebrovasküler hastalık, 2 donörde miyokard enfarktüsü ve 3 donörde kronik böbrek hastalığıydı. Ölüm nedeninin DM rulo oluşumunu etkileyeceği düşünüldü. Ancak gruplar arasında donörlerin ölüm nedenleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,238).

Tüm dokular ameliyathanede soyuldu ve değerlendirmeden hemen önce hazırlandı. Medyan DM soyma süresi 7,0 dakika (aralık, 5-20 dakika) idi ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark yoktu (p=0,946). On altı korneadan sadece bir tanesinde DM rulosu (Grup 1’de) elde edilemedi. Bu lasere DM çalışmadan çıkarıldı.

Hazırlanan DM rulo formasyonları donör korneaya göre değişiklik gösterebilmektedir. Bu çalışmada, bazı dokular daha sıkı rulo oluştururken, diğerleri daha gevşek bir rulo oluşturdu. Toplama anında, 23 °C BSS’de (p=0,273) DM rulo sıkılığı açısından gruplar arasında istatistiksel bir fark yoktu (Tablo 1). Farklı BSS sıcaklıklarında 5 ve 10 dakika sonra DM rulo oluşumu ve doku genişliklerinde hiçbir grupta bir fark gözlenmedi. Sıcaklığı 23 °C olan BSS içinde hazırlanan DM greft ruloları, BSS sıcaklığının 10 dakika süre ile artırılması veya azaltılmasından etkilenmedi. Grupların hiçbirinde DM rulo oluşumlarında sıkılaşma veya açılma gözlenmedi. Resim 2’de DM rulolarının 0. ve 10. dakikadaki görüntüleri gruplar şeklinde gösterilmektedir.

Tartışma

DMEK hazırlığı bazı sistemik hastalıklardan etkilenebilir. Çalışmalar, diabetes mellitus hastası (özellikle hastalık uzun süreli ise) donörlerden ve hiperlipidemik veya obez hastalardan alınan dokulardan hazırlanan DMEK preparatının daha yüksek başarısızlık oranlarına sahip olabileceğini göstermektedir. Diabetes mellitus veya hiperlipidemik veya obez donörlerden alınan dokuların elimine edilmesiyle başarısızlık oranının azaltılabileceği bildirilmiştir.¹¹ İlgili literatür, genel başarısızlık oranının %5,2 olduğunu belirtmektedir.^8,12 Bizim çalışmamızda sadece bir donör korneadan (%6,25) DM grefti elde edilemedi. Stromal yüzeyin sıkı kohesif doğasından kaynaklanan laserasyonlar vardı. Bu donörün ölüm sebebi, diabetes mellitus ve kronik böbrek hastalığıydı ve bu literatürdeki bilgilerle uyumludur.¹¹

Donör yaşı, sistemik hastalıklar ve ölüm sebebinin DM greft hazırlığı, doku eldesi sırasındaki komplikasyonlar ve DM rulo oluşumu üzerinde etkisi olabilir.^3,11,13 Çalışmamızda preoperatif bulgular benzerdi ve gruplar arası farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bu nedenle, bu çalışmada sadece farklı BSS sıcaklıklarının DM rulo formasyonu üzerindeki etkilerini araştırabildik.

Göreceli erken postoperatif endotelyal hücre kaybı ve açılma süresi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bildirilmiştir.³ Açılma süresi uzadıkça endotel hücre kaybı artmaktadır. Başka bir çalışmada 49 yaşından büyük olan donörlerde, donör kornea özellikleri ile greft lamelinin açılma zorluğu derecesi arasında bir korelasyon olmadığı bulunmuştur. Aynı çalışmada, greft açılmasının daha zor olması ile greft dekolmanı ve endotel hücre kaybı oranları arasında anlamlı bir ilişki olduğu bildirilmiştir.¹⁴ DMEK cerrahisinde greft oryantasyonunun canlı intraoperatif optik koherens tomografi ile görüntülenebileceği ve değerlendirilebileceği bildirilmiştir. Ayrıca, ciddi kornea ödemi varlığında daha az greft manipülasyonu ile greftin daha hızlı yerleştirildiği bildirilmiştir.¹⁵ Greft açılmasını kolaylaştırmak için farklı yöntemler halen aranmaktadır.

DMEK greft kornea stromasından ayrıldığında, içte DM ve dışta endotelin olduğu bir rulo oluşturur. Bu oluşum DM’de bulunan tip 4 kollajen ve korneadan ayrıldıktan sonra endotel hücrelerinin davranışları ile ilişkilidir. Greft özelliklerinin greft açılma süresini nasıl etkilediğini inceleyen daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Sıcaklık değişiminin DM rulo sıkılığı üzerine etkisi olup olmadığını gösteren herhangi bir hayvan modeli veya başka çalışma bulamadık.

Postoperatif dönemde prognoz geri kalan endotel hücrelerinin sayısına bağlı olduğu için DMEK cerrahisi ve DM açılma süreleri önemlidir. DM rulosu, ön kamarada en az endotel kaybı ile açılmalı ve alıcı stromaya eklenmelidir. Yakın zamanda, DMEK greftlerinin atravmatik olarak açılması için bazı manevralar tanımlanmıştır.^16,17,18 Bir in vitro çalışmada, endoteli içte olacak şekilde DMEK dokusunun üçe katlanarak aktarılmasının, donör hücrelere cerrahi travmayı azalttığı ve spontan açılmayı kolaylaştırdığı gösterilmiştir.¹⁷ Bununla birlikte, manevralar geliştirilmesine rağmen, postoperatif başarıyı etkileyen standart bir greft açılma yöntemi yoktur ve bazı olgularda DM açılma süresi uzayabilir. Ayrıca, DM açılma süresini etkileyen faktörler bilinmemektedir. DM açılması için kullanılan mevcut yöntemler, grefte doğrudan veya dolaylı mekanik travma ile sonuçlanmaktadır ve bu da endotel hasarına neden olabilir. Bu nedenle, daha az travmatik yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir.

DM açılmasında zorluk yaşadığımız bazı durumlarda, greftin zamanla spontan açıldığını gözlemledik. Bunun mikroskop ışığı altında ısınma ile ilişkili olabileceğini varsayarak, bu çalışmadan elde edilen DM rulolarını farklı sıcaklıktaki BSS’ler içine koyduk ve bunların kendiliğinden açılıp açılmadığını gözlemledik. Açılmayı etkileyecek tüm manevralardan kaçındık ve sadece sıcaklığın etkisini araştırdık. Ancak, 8 °C, 16 °C, 23 °C (rutin olarak kullandığımız BSS sıcaklığı) veya 36 °C BSS sıcaklıklarında DM rulolarında 10 dakikalık süre içinde hiçbir değişiklik gözlenmedi.

Çalışmamızda DM rulolarında sıkılaşma veya açılma meydana gelmedi. Normal fizyolojik vücut ısısı olan 36 °C’nin, DM rulolarının açılmasını destekleyeceğini düşünmüştük. Ancak böyle bir etki gözlemlemedik. BSS sıcaklığının DM ruloları üzerindeki etkisini moleküler düzeyde göstermememize rağmen, bu etkinin greftin açılma süresini değiştirmediği gözlenmiştir. Domuz kornea endotel hücrelerinin kullanıldığı bir çalışmada, buzdolabında saklanan göz irrigasyon çözeltisinin, kornea endotel hücrelerini, klimatizasyonu yapılan odada saklanan BSS’den daha fazla ısı hasarından koruduğu bulunmuştur.¹⁹ Sonuç olarak, DM grefti için daha düşük sıcaklıkta BSS tercih edilmesi avantajlı ve rasyonel olabilir çünkü BSS sıcaklığının daha yüksek olması DM grefti açılma süresi açısından yarar sağlamamaktadır.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

Bu çalışmanın bazı kısıtlılıkları bulunmaktadır. İlk olarak, endotelyal patolojiyi saptamak için biyomikroskobik inceleme yapıldı ve endotelyal hücreler sayılamadı. Speküler mikroskopi yapma şansımız olsaydı, endotelyal inceleme biyomikroskopik incelemeden daha değerli olurdu. İkincisi, ön kamaraya doku yerleştirilmesi simüle edilemedi.

Sonuç

Sonuç olarak, bu çalışmada farklı BSS sıcaklıklarının DM açılma süresi üzerinde etkisi olmadığı bulunmuştur. Endotel hücre kaybını azaltmak için daha az travmatik olan ve DM açılmasını kolaylaştıracak yöntemler araştırılmalıdır.