ÖZET
Amaç:
Rac1, Rac2 ve Rac3 ekspresyonlarının pterjium dokusundaki rollerini belirlemek ve bu ekspresyonları normal konjonktival doku ile karşılaştırmak.
Gereç ve Yöntem:
Primer pterjiumlu 78 hasta çalışmaya alındı. Kontrol dokusu olarak pterjium operasyonu sırasında alınan sağlıklı konjonktival greft örnekleri kullanıldı. Genomik mRNA’da gen ekspresyonları analizi için BioMark HD dinamik dizi sisteminde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi kullanıldı. Protein ekspresyonları, western blot ve immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak analiz edildi.
Bulgular:
Pterjium dokularında RAC1, RAC2 ve RAC3 gen ekspresyonu, kontrol örnekleriyle karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde yükselmedi (p>0,05). Çok düşük düzeyde RAC1 gen ekspresyonu gözlendiğinden, Rac2 ve Rac3 proteinleri ile ileri protein ekspresyon analizleri yapıldı. Western blot ve immünohistokimyasal analizleri, pterjium dokularında Rac2 ve Rac3 protein ekspresyonlarında anlamlı bir değişiklik kaydedilmediğini ortaya koydu (p>0,05).
Sonuç:
Bu, Rac proteinlerinin pterjiumdaki katkısını belirleyen ilk çalışmadır. Sonuçlarımız, küçük GTP bağlayıcı protein Rac’ın pterjiyum patogenezinde yer almayabileceğini göstermektedir.
Giriş
Pterjiyum, korneada anormal konjonktival fibrovasküler doku büyümesi ile karakterize iyi huylu ve sık görülen bir oküler yüzey hastalığıdır. Patolojik olarak pterjiyum proliferatif, invaziv ve oldukça vaskülarize bir dokudur. Pterjiyumun konjonktival dejeneratif ve proliferatif bir hastalık olduğu kabul edilmektedir. Pterjiyum ve neoplazi arasında çeşitli ortak özelliklerin bulunması nedeniyle pterjiyum, neoplastik benzeri büyüme lezyonu olarak kabul edilmektedir.1 Enflamasyon, ultraviyole ışına maruziyet ve kronik iritasyon gibi birçok çevresel faktörün patogenezde rol oynadığı varsayılmıştır.2 Pterjiyum etiyolojisinde genetik faktörler de önemlidir.3 Ancak pterjiyum gelişimine neden olan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Giderek artan veriler, birçok büyüme faktörünün pterjiyum patogenezine doğrudan veya dolaylı olarak katkıda bulunabileceğini göstermektedir.4 Bazı çalışmalarda siklooksijenaz, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ve çeşitli proenflamatuvar sitokinlerin pterjiyum gelişimi ile ilişkili olduğu bildirilmiştir.5,6,7
Düşük molekül ağırlıklı (20-30 kDa) küçük GTPazlar guanin nükleotidlerini bağlayan ve guanozin trifosfatı (GTP) guanozin difosfata hidrolize eden monomerik G-proteinleridir. Küçük GTPazlardan oluşan insan Ras ailesi, fonksiyonel ve sekans benzerliklerine göre beş ana alt aileye (Rho, RAS, Arf/sar, Rab, Ran) ve “sınıflandırılmamış” proteinlere ayrılan 166 proteinden oluşur.8 Küçük GTPazlardan oluşan Rho ailesi, Rac1, Rac2 ve Rac3 dahil olmak üzere 20 proteinden oluşan bir ailedir. Farklı genler tarafından kodlanan üç farklı memeli Rac izoformunun amino asit dizileri arasında %89 ile %92 arasında benzerlik bulunur.9 Rho GTPazın VEGF ile indüklenen hücre göçünde rol alan proteinleri aktive ettiği ve VEGF sinyalleşmesinin kemotaksis sırasında Rac aktivasyonuna ihtiyaç duyduğu bildirilmiştir.10,11 Rac aktivasyonu ayrıca endotelyal hücre fokal adezyonunda ve stres lifi oluşumunda bir artışa neden olur.11 Etkin hücre hareketi ve migrasyonu için Rac aktivitesi çok önemlidir.12,13 Bu etkiler pterjiyumda konjonktiva dokusunun kanat benzeri veya üçgen şekilli doku büyümesine katkıda bulunabilir. Fagositik ve fagositik olmayan hücrelerde bulunan nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidaz enzimi Rac tarafından düzenlenen bir komplekstir ve hücre içi sinyalleme ve doğuştan gelen bağışıklıkta reaktif oksijen türlerinin (ROS) ortaya çıkmasını sağlar.14 Rac proteinleri fagositik hücrelerdeki oksidatif patlamayı düzenleyebildiğinden ve ROS üretiminde rol oynadığından, Rac pterjiyum gelişiminin enflamatuvar süreçlerine katkıda bulunabilir.15,16 Rac ailesi üyelerinin belirli hücresel işlevlerde çeşitli rolleri olsa da, pterjiyum patofizyolojisindeki rolleri karakterize edilmemiştir. Bu nedenle, bu araştırmanın amacı, pterjiyum dokusunda küçük GTP bağlayıcı proteinler Rac1, Rac2 ve Rac3’ün ekspresyonunu değerlendirmektir.
Gereç ve Yöntem
Hastalar
Bu prospektif çalışma Gaziantep Üniversitesi Hastanesi, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Gaziantep Dr. Ersin Arslan Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Göz Hastalıkları Kliniği’nde gerçekleştirildi. Çalışma için Gaziantep Üniversitesi Yerel Klinik Etik Kurul’dan onay alındı (karar no: 2017/312, tarih: 11.09.2017) ve çalışma boyunca Helsinki Bildirgesi’nin ilkelerine bağlı kalındı. Pterjiyum örnekleri, primer pterjiyumlu 78 ardışık hastadan (40 erkek ve 38 kadın) ameliyat sırasında toplandı. Pterjiyum eksizyonu ve konjonktival otogreft transferi ameliyatı sırasında superior temporal bulber konjonktivadan normal konjonktival doku örnekleri alındı.17 Her hastaya rutin göz muayenesi yapıldı. Hastaların çalışmaya dahil edilme kriterleri: (1) 18 yaşından büyük olmak; (2) primer evre 2 veya 3 pterjiyum varlığı; ve (3) çalışmaya gönüllü olarak katılarak bilgilendirilmiş yazılı onam vermek.
Araştırmaya dahil edilmeme kriterleri ise: (1) Pterjiyum eksizyonu, vitrektomi, trabekülektomi, katarakt ekstraksiyonu ve şaşılık ameliyatı gibi geçirilmiş göz cerrahisi öyküsü; (2) son üç ay içinde kimyasal yaralanma veya konjonktival laserasyon gibi travma öyküsü; (3) başka konjonktival veya korneal patoloji varlığı; (4) Sjögren sendromu gibi başka oküler yüzey hastalığı olması; (5) konjonktivit gibi enfeksiyon varlığı; (6) immünosupresan, mitomisin C veya kortikosteroidler gibi topikal ilaç kullanımı öyküsü; ve (7) şu anda veya daha önce kontakt lens kullanılması olarak belirlendi.
Gen Ekspresyonu Analizi
Total RNA, üreticinin talimatlarına göre miRNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Almanya) kullanılarak dokulardan izole edildi. RNA’nın saflığı ve konsantrasyonu spektrofotometrik olarak (Epoch, BioTek, Winooski, VT, ABD) ölçüldü. RNA’dan cDNA sentezi, Ipsogen RT Kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak üretici tarafından önerilen protokole uygun şekilde gerçekleştirildi. RAC primerleri ile polimeraz zincir reaksiyonu ölçümleri BioMark HD sistemi (Fluidigm, South San Francisco, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. Her genin ekspresyonu ölçüldü ve mesajcı RNA (mRNA) ekspresyonu belirlendi. b-aktin (ACTB) internal kontrol için referans gen olarak kullanıldı. Rölatif mRNA seviyeleri 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak şu formüle göre ölçüldü: ΔΔCt = ΔCtRAC – ΔCtACTB . Bu formülde Ct = eşik döngüsünü ifade etmektedir.17
Western Blot Analizi
Donuk doku örnekleri, doku homojenizatörü (Tissue Lyser LT, Qiagen, Hilden, Almanya) kullanılarak HEPES tamponunda homojenize edildi ve analiz edilene kadar -80 °C’de saklandı. Protein konsantrasyonları Bradford yöntemi (Thermo Fisher Scientific, IL, ABD) ile belirlendi. Protein örnekleri, bir örnek tamponu (5 µL) ve HEPES tamponu ile inkübe edildi ve 95 °C’de 5 dakika ısıtıldı. Daha sonra, doku örneklerinden alınan 20 µg protein, %10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jellerde yürütüldü ve gece boyunca 4 °C’de poliviniliden diflorür (PVDF) membranlara elektroblotlandı. Yağsız kuru süt ile uygun şekilde bloke edilip ve yıkandıktan sonra, membranlar gece boyunca Rac2 (sc -517424, SantaCruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD, 1/300) veya Rac3 (ab124943, Abcam, Cambridge, İngiltere, 1/1000) primer antikorlarını içeren solüsyonda 4 °C’de bekletildi. b-aktin (sc -47778, SantaCruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD, 1/1000) antikoru yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Daha sonra PVDF membranlar sekonder antikorlar ile 90 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi (Rac2 için anti-mouse immunoglobulin G [IgG] 1/1000, sc-516102, SantaCruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD, veya Rac3 için keçi anti-tavşan horseradish peroksidaz, 1/3000, ab6721, Abcam, İngiltere). Antikor reaktif bantlar, artırılmış kemilüminesans sinyaller (Super Signal West Pico, kat. no. 34080, Thermo Fisher Scientific, IL, ABD) kullanılarak görselleştirildi. Bantların yoğunlukları bir jel görüntü analiz sistemi (ChemiDoc XRS+ Imager, Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) kullanılarak kaydedildi, daha sonra b-aktin seviyeleri ile normalize edildi.17
İmmünohistokimyasal Analiz
İmmünohistokimyasal çalışmaları gerçekleştirmek için, formalinle fikse edilmiş ve parafine gömülmüş doku blokları, bir mikrotom kullanılarak 5 µm kalınlıkta kesildi. Rac2 (PA5-29281, poliklonal tavşan IgG, Thermo Fisher Scientific, Rockford, ABD, 1/100) ve Rac3 (EPR6679B, tavşan monoklonal anti-Rac3 antikoru, Abcam, Cambridge, ABD, 1/100) antikorları otomatik immünohistokimya boyama cihazı (Ventana, Bench Mark Ultra Auto-Stainer, Roche Diagnostics, IN, USA) kullanılarak uygulandı. Rac2 ve Rac3 immünreaktivitelerinin yoğunluğu 0-3 derecelendirme ölçeğinde skorlandı. Tek bir araştırmacı (O.E.) tüm örneklemleri tutarlılık açısından skorladı. Boyanma miktarı şiddeti şu şekilde derecelendirildi: 0, <%10 veya negatif; 1+, %11 ila 20; 2+, %21 ila 75; 3+, >%75.17
İstatistiksel Analiz
Veriler ortalama ± standart hata veya yüzde olarak sunuldu. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Kolmogorov-Smirnov testi ile değerlendirildi. İki grubun ortalama değerlerini uygun şekilde karşılaştırmak için eşleştirilmemiş Student t-testi veya Mann-Whitney U testi kullanıldı. Gen ekspresyon analizi için QIAGEN GeneGlobe çevirim için yazılımı (http://www.qiagen.com/geneglobe) kullanıldı. Tüm sonuçlar kat değişim olarak sunuldu, 0,001 ile 0,5 arasındaki değerler anlamlı downregülasyon ve 2,0’ın üzerindeki değerler anlamlı upregülasyon olarak kabul edildi.18 İmmünohistokimyasal skorlar arasındaki anlamlı değişimi belirlemek için Mann-Whitney U testi kullanıldı. Korelasyonlar, Spearman sıra korelasyon testi ile araştırıldı. İstatistikler GraphPad Instat (sürüm 3,05, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD) kullanılarak yapıldı. P değerinin 0,05’ten küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bulgular
Yetmiş sekiz pterjiyum hastasının cinsiyet dağılımı yaklaşık eşitti (40 erkek [%51,3] ve 38 kadın [%48,7]). Hastaların ortalama yaşı 52,4±1,4 yıl (aralık 29-72 yıl) idi. Kontrollerle karşılaştırıldığında pterjiyum dokularında RAC1, RAC2 ve RAC3 gen ekspresyonu açısından belirgin bir fark yoktu (n=30, p değerleri RAC1, RAC2 ve RAC3 için sırasıyla 0,819, 0,326 ve 0,112 idi, Şekil 1). RAC1 ekspresyonu çok düşük düzeyde olduğundan, ileri analizler Rac2 ve Rac3 proteinleri ile yapıldı. Western blot analizinde, pterjiyum dokularında Rac2 ve Rac3 protein ekspresyonunda kontrollere kıyasla belirgin bir fark yoktu (n=30, p değerleri Rac2 ve Rac3 için sırasıyla 0,330 ve 0,309 idi, Şekil 2).
İmmünohistokimyasal kesitlerde, esas olarak pterjiyum epitel ve kapiller endotel hücrelerinde lokalize olan Rac2 (Şekil 3A, B) ve Rac3 (Şekil 3C, D) boyanması zayıftı. Pterjiyum dokusunda hemen hemen hiç stromal hücre boyanması izlenmedi. Ancak, bu hücreler kontrol örneklerinde Rac2 veya Rac3 antikorları ile boyandı (Şekil 3). Pterjiyum dokusunda Rac2 veya Rac3 upregülasyonu için eğilim olmasına rağmen, bu artışlar istatistiksel anlamlılık göstermedi (p değerleri Rac2 ve Rac3 için sırasıyla 0,2113 ve 0,2524, Şekil 4).
Korelasyon analizinde RAC1 ve RAC2 gen ekspresyonları arasında (r=0,606, r2=0,367, p<0,001) ve RAC2 ve RAC3 gen ekspresyonları arasında (r=0,367, r2=0,135, p=0,046) pozitif korelasyon olduğu bulundu. Gen ve protein ekspresyonları arasında anlamlı korelasyon saptanmadı (Rac2 için p=0,239, Rac3 için p=0,609). Rac2 ve Rac3 protein ekspresyonları arasında da anlamlı korelasyon yoktu (r2=0,012, p=0,531).
Tartışma
Çalışmamızda normal konjonktival dokulara göre primer pterjiyum örneklerinde RAC1, RAC2 ve RAC3 gen ekspresyonu anlamlı düzeyde değişmemiştir. Ayrıca, protein ekspresyonunda bir artış gözlenmedi. Bu bulgular, gen ekspresyonunun ve posttranslasyonel Rac protein yapımının, pterjiyum gelişiminde veya oküler yüzeyde pterjiyum büyümesinin düzenlenmesinde rol oynamadığını göstermektedir. Her ne kadar çeşitli çalışmalarda hücresel bağışıklık ve enflamatuvar yanıtın pterjiyum oluşumunda çok önemli bir rol oynadığı bildirmiş olsa da,19,20 sonuçlarımız Rac proteinlerinin pterjiyum gelişiminin enflamatuvar sürecine katıkıda bulunduğu fikrini desteklememektedir.
Rac aktivitesi hücre hareketi için gereklidir.12 Rac’ın genellikle ilk hücre-hücre temas, hücre-matris adezyonu ve hücresel transformasyonun düzenleyicisi olduğu kabul edilmektedir.21,22,23 Rac’ın, fibroblastlarda lamellipodia ve membran kıvrımlarını (“membrane ruffles”) uyardığı bilinmektedir ve Rac sinyallemesi hücre migrasyonu için gereklidir.13 Skarlaşma ve fibrozis süreçlerinde rol alan fibroblastların, pterjiyumun ilerlemesine katkıda bulunabileceği bilinmektedir.24 Rac’ın epitel hücrelerinde lamellipodial uzantıların gelişimini modüle ettiği ve komşu hücreler arasındaki etkileşimleri kolaylaştırdığı düşünülmektedir.21,22 Rac GTPazları kemotaktik migrasyonda polaritenin sürdürülmesi veya oluşturulması için de önemlidir.25 Bu nedenle, Rac hücre polarizasyonunu ve göçünü kontrol ediyor olabilir.12 Sitokinler, hücre dışı matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri tarafından tetiklenen lamellipodium uzaması için Rac gereklidir.12 Rac’ın tüm bu özellikleri, pterjiyumda görülen konjonktival dokunun kornea üzerinde kanat şeklinde büyümesine katkıda bulunabilir.
En çok araştırılmış Rac izoformu olan Rac1, gen ekspresyonunu, hücreler arası adezyon, hücre döngüsü, hücre yayılımına ve membran kıvrılmasına yardımcı olmak için aktin hücre iskeletinin organizasyonunu modüle eder.26 Rac proteinlerinin ekspresyon düzeyi ve doku dağılımı önemli ölçüde farklılık gösterir. Rac1 ve Rac3 farklı dokularda yüksek miktarda eksprese edilir ve bu nedenle çok çeşitli hücresel fonksiyonları modüle ederken, Rac2 büyük ölçüde hematopoietik hücrelerde eksprese edilir.27,28,29 Ayrıca, Rac2 makrofajlarda fagositoz için gereklidir.30 Rac2’nin özellikle kemotaksiyi, hücresel farklılaşmayı, proliferasyonu, aktin yeniden modellenmesini ve nötrofillerde süperoksit ve kinaz aktivasyonunu düzenlediği düşünülmektedir.29,31,32 Rac2, makrofajlarda siklooksigenaz-2 ekspresyonunda önemli rol oynar,33 ve siklooksigenaz-2 ekspresyonu da pterjiyum patogeneziyle ilişkilidir.5 Rac1 ve Rac2, süperoksit üreten NADPH oksidazın düzenleyici bir bileşeni olarak hareket eder ve fagositik hücrelerde oksidatif patlamayı düzenler.15 Rac, ROS üretimine doğrudan katkıda bulunur.16 ICAM-2 ve ICAM-3 gen ve protein ekspresyonlarının pterjiyum dokusunda anlamlı artış gösterdiğine ait kanıtlar vardır17 ve ICAM-2 Rac1 sinyallemesi yoluyla N-kaderin lokalizasyonunu ve vasküler geçirgenliği düzenleyebilir.34 Bununla birlikte, bu çalışmadaki bulgularımız, RAC1 gen ekspresyonunun pterjiyum dokusunda belirgin şekilde değişmediğini göstermiştir.
Verilerimiz, RAC2 geninin ve Rac2 proteininin pterjiyum dokusunda eksprese edildiğini göstermiştir, bu da Rac2’nin hematopoetik hücrelerle sınırlı olmadığına işaret etmektedir. Bu görüşü destekleyen iki raporda vasküler düz kas hücrelerinde (VDKH) Rac2 ekspresyonu gösterilmiştir.35,36 Rac2 ekspresyonu sakin veya normal koşullar altında tespit edilemese de, ekspresyonu VDKH’nin enflamatuvar sitokinlerle indüklenmesiyle uyarılır. Rac2’nin aşırı ekspresyonu VDKH göçünü ve hücre içi süperoksit anlamlı önemli ölçüde artırır.36 VDKH’de tümör nekroz faktörü-a ve dönüştürücü büyüme faktörü-b’nın Rac2 ekspresyonunu artırabildiği gösterilmiştir.36 Bu büyüme faktörleri pterjiyum dokusunda da mevcuttur.4 Rac2, endotel hücrelerinde eksprese edilir ve ayrıca endotel hücre göçü için gerekli bir sinyaldir.37 Rac2 insan bronşiyal epitel hücrelerinde de bulunur ve Rac2 artışı NADPH oksidaz aktivitesi ve hücre içi ROS yapımının artmasına neden olur.38 Ayrıca Rac2 tümör hücrelerinde eksprese edilir. Malign beyin tümörlerinde Rac2’nin ekspresyonunun azaldığı bildirilmesine rağmen, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomda aşırı eksprese olduğu gösterilmiştir.39,40 Pterjiyum tümör benzeri özellikler gösterebilir ve neoplastik benzeri bir büyüme bozukluğu olduğu ileri sürülmüştür.41
Rac3 en az çalışılan Rac izoformudur. Sonuçlarımız ilk kez Rac3 ekspresyonunun pterjiyum dokusunda tespit edilebilir olduğunu göstermektedir. Her ne kadar Rac3 stres aktivasyon yolağı ve tümör büyümesinde rol alabilse de, pterjiyum patogenezine katkısı şu anda bilinmemektedir.9,42
Çalışmanın Kısıtlılıkları
Çalışmamızın ana kısıtlılığı hasta sayısının düşük olmasıdır. Daha büyük örneklem sayısı ile yapılacak ileri çalışmalar bu hastalığın hücresel özelliklerine ışık tutmaya yardımcı olabilir.
Sonuç
Bu çalışma, pterjiyumda küçük GTP bağlayıcı proteinler Rac1, Rac2 ve Rac3’ün gen ekspresyonunu gösteren ilk çalışmadır. Bununla birlikte, gen ve protein ekspresyonları normal konjonktival dokudan farklı bulunmamıştır, bu da Rac proteinlerinin pterjiyum gelişiminde rol oynamayabileceğini düşündürmektedir. Pterjiyumda Rac aracılı fonksiyonlarda rol oynayan sinyal yolakları henüz bilinmemektedir ve bu proteinlerin her birinin pterjiyumdaki rolünün aydınlatılması için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Etik
Etik Kurul Onayı: Çalışma için Gaziantep Üniversitesi Yerel Klinik Etik Kurul’dan onay alınmıştır (karar no: 2017/312, tarih: 11.09.2017).
Hasta Onayı: Alınmıştır.
Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.
Yazarlık Katkıları
Cerrahi ve Medikal Uygulama: K.G., B.D., Konsept: A.T.D., Dizayn: A.S., A.T.D., Veri Toplama veya İşleme: K.G., B.D., Ş.D., Analiz veya Yorumlama: A.S., Ö.E., E.T., Literatür Arama: K.G., Ş.D., A.T.D., Yazan: A.T.D.
Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.
Finansal Destek: Bu çalışma Gaziantep Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından (TF.DT.17,45) desteklenmiştir.