ÖZET

Görme fonksiyonunun iyi olabilmesinin ilk koşulu, korneanın saydam olmasıdır. Korneanın saydam olabilmesi için ise diferansiyasyonunu tamamlamış yüzeyel hücrelerin dökülmesi ile sürekli yenilenen epitel tabakasının düzenli ve avasküler yapısını koruması zorunludur. Yenilenen epitel hücrelerinin kaynağı, limbus bölgesinde yerleşen kök hücrelerdir. Kornea vaskülarizasyonu ve opaklaşma ile giden körlük, tüm dünyadaki körlüklerin yaklaşık olarak %10’unu oluşturmaktadır (6-10 milyon kişi) ve limbal kök hücre yetmezliğinde bu türde körlük yapan faktörlerin başında gelmektedir. Kimyasal/ısı yanıkları, Steven Johnson sendromu, konjenital/genetik anomaliler gibi birincil veya ikincil herhangi bir nedenle limbal kök hücrelerin fonksiyonunu kaybetmesi, konjonktiva epitelinin kornea üzerine yürümesine, skar-vaskülarizasyon gelişimiyle ciddi görme kaybı oluşmasına neden olmaktadır. Günümüzde bu patolojinin etkin tedavi seçenekleri sınırlıdır. Tek gözün etkilendiği olgularda diğer gözden otolog limbal doku transplantasyonu ile görmenin tekrar elde edilmesine çalışılmaktadır. Ancak sağlam gözü aynı hastalık açısından riske atmamak için, mümkün olduğunca küçük doku kullanılmakta ve tedavinin tekrarlanmasından kaçınılmaktadır. İn vivo olarak limbal epitel hücrelerin yalnızca %1-2’si kök hücredir. Klinik başarıda en önemli etken nakledilen dokunun yeterli miktarda kök hücre içermesidir. Bu sebeplerle, kök hücrelerini kültür ortamında korumak ve çoğaltmak adına çeşitli girişimlerde bulunulmaktadır. İlk kez limbal kök hücrelerin in vitro çoğaltılabileceğini ve limbal kök hücre yetmezliği tedavisinde kullanılabileceğini gösterilmesinden sonra günümüze kadar geçen 20 yılda, limbal epitel hücre kültürlerinde birçok farklı yöntem kullanılmıştır. Bu uygulamalar içinde en başarılı ve sıklıkla kullanım bulan yöntem, limbal biyopsinin biyo-uyumlu bir materyal üzerinde (tercihen insan amniyon membranı) eksplant kültür olarak çoğaltılması ve bu dokunun (kültüre edilmiş limbal epitelyal hücre) cerrahi olarak nakledilmesidir. Günümüzde hücresel ürün kullanımına ilişkin değişen yasal düzenlemeler sonucu ülkemiz ve tüm dünyada artık kültüre edilmiş limbal epitelyal hücre naklinin iyi laboratuvar uygulamaları kapsamında, hayvansal ürünlerden arındırılmış ürünlerle (xenofree) hazırlanarak kullanımı yaygın kabul görmektedir.

Giriş

Limbal Kök Hücre Yetmezliği

Limbal kök hücre yetmezliği (LKHY), etiyolojisinde birçok faktörün yer aldığı, korneanın rejeneratif yeteneğini kısmen ya da tamamen kaybetmesi ile ortaya çıkan karmaşık bir patolojidir.¹ Limbal bölgenin ciddi hasarlanmasını takiben gelişen kök hücre kaybı, kalıcı korneal epitel defektleri ve konjonktivalizasyona bağlı görme kaybı ile sonuçlanmaktadır (Resim 1).²

Etiyoloji

LKHY’ye neden olan durumlar, birincil ve ikincil nedenler olarak başlıca ikiye ayrılmaktadır (Tablo 1). Klinikte, sekonder nedenler, etiyolojide genetik faktörlerin rol oynadığı primer nedenlerden (örneğin; aniridi, Resim 2) daha sık olarak karşımıza çıkmaktadır.^3,4

Semptom ve Bulgular

LKHY’deki semptomlar, nonspesifik olup bu semptomlar arasında azalmış görme keskinliği, fotofobi, sulanma, blefarospazm, kronik enflamasyona bağlı kızarıklık ve epitelyopati nedeni ile tekrarlayan ağrı atakları bulunmaktadır.^4,5

Biyomikroskobik muayenede, kornea epitelinin donuk ve düzensiz reflesi görülür. LKHY ağırlığına bağlı olarak, kalın fibrovasküler pannus oluşumu, kronik keratit, skarlaşma ve kalsifikasyon ortaya çıkabilmektedir. Korneanın konjonktivalizasyonu sonucundaki geçirgenlik artışına bağlı olarak, korneanın floresein tutulumu da sıklıkla anormal olmaktadır.⁴

Tanı

LKHY’de, kesin tanı konulması önem taşımaktadır. Kesin tanı konulamaması, bu hastalıkta sonuçları oldukça kötü olan kornea transplantasyonu uygulamasının yapılmasına neden olabilmektedir.⁶

LKHY’nin tüm bulgularına rağmen, tanıda yalnızca konjonktivalizasyon ve korneal yüzey üzerine goblet hücre göçü özellik taşımaktadır. Konjonktivalizasyonun klinik bulguları arasında, Vogt limbal palizatlarında bozulma veya korneada gecikmiş floresein boyanması sayılabilir. Konjonktivalizasyonun asıl tanısı, impresyon sitolojisi ile korneada goblet hücrelerinin varlığının gösterilmesi yoluyla konulabilmektedir (Resim 3).¹

Tedavi Yöntemleri

LKHY tedavisinde, çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır. Bunlar arasında otolog ve allogreft limbal greft transplantasyonları ile günümüzde giderek önem kazanan kültüre edilmiş limbal epitel hücre (KLEH) transplantasyonu yer almaktadır.⁶

Tek taraflı LKHY’de, literatürde %80 düzeylerini geçen başarı oranı bildirilen otolog limbal greftler kullanılabilmektedir.^7,8 Otolog limbal greftlerde her ne kadar kesin olarak kanıtlanmış olamasa da verici yatakta LKHY gelişme riski, yeterli donör doku elde edilmesini kısıtlamaktadır.⁹

Bilateral LKHY’de, allogreft kullanımı söz konusu olmakla birlikte yöntemin başarısı immün reaksiyon ve allogreft rejeksiyonu riski nedeni ile kısıtlıdır.^5,6 Keratolimbal allogreftlerin uzun dönem başarı beklentisi düşük olup yaklaşık olarak %50 oranında bildirilmektedir.^10,11

Her ne kadar birçok cerrahi yöntem bulunsa da, ciddi LKHY olan hastalarda, özellikle de bilateral olgularda, halen güvenilir ve etkin bir tedavi yöntemi mevcut değildir.6 Tüm bu nedenlerle, limbal hücre kültürü gibi yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi kaçınılmaz hale gelmiştir.^{12,13,14,15,16,17}

Son yıllarda klinik uygulamalarda yer almaya başlayan görece yeni hücresel tedavi yaklaşımlarının, biyolojik arka planları halen net olarak bilinmemektedir. Özellikle limbal kök hücrelerin karakteri ve mikro çevreleri, günümüz limbal kök hücre kültürü çalışmalarının en önemli araştırma konuları arasındadır.¹⁸ Kültür ortamında üretilen limbal kök ya da öncül hücrelerin transplantasyonuna dayalı geliştirilmiş ve halen geliştirilmekte olan tekniklerin, halen hangi yöntemin en uygun olduğu tartışmalı olsa da yaklaşık allojenik olanda %73 otolog olanda ise %77 başarı oranı¹⁹ ile ciddi oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde kullanılabilir olduğu gösterilmektedir.^12,16,20

İlk kez 1997 yılında Pellegrini ve ark.¹³, Lancet dergisinde yayınladıkları çalışmalarında, limbal kök hücrelerin “feeder layer” (besleme tabakası) üzerinde üretilebildiğini bildirmişlerdir. Daha sonraki yıllarda araştırmacılar, insan amniyon membran (iAM) üzerinde üretilen otolog limbal epitel hücrelerini kornea rekonstrüksiyonunda kullanmışlardır.¹⁷ Fakat bu yaklaşımlar tamamıyla stratifiye olmuş ve iyi differansiye epitel tabakalarının oluşmasını sağlayamamıştır. Limbal kök hücreye özgü işaretleyiciler tam olarak belirlenemediğinden, bu hücrelerin fiziksel izolasyonu yeteri derecede yapılamamaktadır. Dolayısıyla çalışmalar çoğunlukla, limbal epitel hücrelerinin farklılaşmasını sağlayan genleri kontrol eden, kök hücre ortamını oluşturacak mikro çevrenin karakterizasyonu ve limbal bazal epitelde bulunan geçici çoğalan hücrelerin farklılaşması için gerekli sinyallerin bulunması yolunda olmuştur.^21,22,23,24

Günümüzde uygulaması yaygınlaşan KLEH nakli, halen var olan tekniklerle geliştirilebilmiş en ileri tedavi yöntemidir. Kök hücre ve mikro çevreye ait özelliklerin daha iyi tanımlanabilmesiyle ve yeni kök hücre kaynaklarının bulunması ve geliştirilmesi ile gelecekte daha iyi klinik sonuçların alınabileceği ideal tedavilerin gelişmesi mümkün olacaktır.^3,25,26

Kültüre Edilmiş Limbal Epitel Hücreleri

Kültür için doku kaynakları: KLEH için temel doku kaynaklarını, unilateral olgularda genellikle hastanın sağlam olan diğer gözünden alınan otolog limbal biyopsi dokuları, bilateral olgularda ise yaşayan akrabadan ya da kadavradan alınan allojenik limbal biyopsi dokuları oluşturmaktadır.^27,28,29

Kültür metodu: Yaklaşık 1x2 mm boyutlarındaki limbal biyopsi verici gözden alındıktan sonra kültür işlemleri amacıyla laboratuvar ortamına transfer edilmektedir. Başlıca kültür metotları, hücre süspansiyon kültürü ve eksplant kültür olarak ikiye ayrılmaktadır.³⁰

a. Süspansiyon kültürü: Bu yöntemde, limbal bölgeden alınan biyopsi örneği dispaz, tripsin, kollajenaz gibi enzimlerle parçalanarak tek tek hücre yapısına dönüştürülmektedir. Elde edilen tek hücreler, kültür ortamında çoğaltılmaktadır.^31,32

b. Eksplant kültürü: Bu yöntem eksplant dokunun bir yüzey materyali üzerine yerleştirilerek, hücrelerin dokudan yüzey materyali üzerine doğru çoğalarak büyümesi (Resim 4) şeklinde yapılmaktadır.³³

Her iki kültür yönteminde de in vitro büyümeyi güçlendirmek için çeşitli kültür bileşenleri kullanılır.

Kültür Bileşenleri

a. 3t3 hücreleri: 3t3 hücreleri, fare fibroblastları olup kültürde epitel tabakası oluşumunu sağlaması amacıyla yaygın kullanım bulmuştur. Ancak bu hücrelerin kullanımı teorik olarak hayvansal hücre transplantasyonu, enfeksiyon ve rejeksiyon riskini arttırması ve mikrokimerizm gibi riskleri taşımaktadır. Bu nedenle klinik uygulamalarda çok fazla tercih edilmemektedir.³⁴

b. iAM: iAM, immünojenik olmayan ve yara iyileşmesinde çok uzun yıllardır klinik pratikte de kullanılan bir biyo-membrandır.³⁵Araştırmacıların çoğu, morfolojik çalışmaların deepitelize iAM kullanımının, limbal epitel büyümesini daha iyi desteklediğini göstermesi nedeniyle membranı deepitelize haliyle kullanmayı tercih etmektedir.¹⁴ Halen KLEH nakli klinik pratiğinde en çok kullanılan yüzey yapısı olsa da, iAM’nin, biyolojik değişkenliğinin olması, kesinleşmiş bir hazırlama standardizasyonunun bulunmaması ve teorik olarak enfeksiyon riski taşıması gibi dezavantajları mevcuttur.^19,36,37

c. Fibrin jel: Fibrin jel, fibrinojenden oluşan biyo-emilimi olan bir membrandır. iAM gibi yine insan kökenli fibrinojen içerdiği için teorik olarak enfeksiyon bulaş riski dışlanamamaktadır.^38,39,40

Kültür ortamı: Limbal epitel hücre kültürü sürecinde epitel çoğalmasının ve büyümenin sağlanması amacıyla kültür ortamı, serum ile zenginleştirilmektedir. Bu amaçla çok uzun yıllar sığır serumu kullanılmış olsa da^13,41,42 son yıllardaki yasal düzenlemeler ile hayvansal ürünlerden arındırılmış kültür hazırlanmasının ön plana çıkması nedeni ile otolog serum kullanımı hız kazanmıştır.^43,44

Kültür süresi: Kültür süresi yaklaşık 2 hafta olmakla beraber, “air lifting” denilen ve kültürü hava sıvı ara yüzeyi ile temasta bırakarak kültür epitelinin çok katlı hale getirilmesi yönteminin kullanıldığı durumlarda bu süre uzamaktadır.^{19,39,40,44,45,46}

Kültüre Edilmiş Limbal Hücre Nakli

a. Oküler yüzeyin hazırlanması: LKHY bulunan göze (Resim 5a), KLEH nakli öncesi, peritomi yapılır (Resim 5b), oküler yüzeydeki fibrovasküler pannus dokusu temizlenir (Resim 5c), gerekli olan durumlarda yüzeyel keratektomi yapılır. Kanama kontrolü koter ile sağlandıktan sonra oküler yüzey KLEH nakline hazır hale gelir (Resim 5d).

b. KLEH nakli: KLEH laboratuvardan ameliyathaneye transfer edildikten sonra, hazırlanmış oküler yüzeye epitel tarafı üstte olacak şekilde nakledilir. Genellikle 10-0 naylon sütürler ile kornea ve veya episkleraya tespit edilir (Resim 5e).

c. Koruyucu membran/Kontakt lens uygulaması: KLEH nakli tamamlandıktan sonra genellikle bir koruyucu iAM veya bazı araştırmacılar tarafından da bandaj lens kullanımı nakledilen hücrelerin kapak hareketine bağlı negatif etkilenmesini önlemek adına kullanılmaktadır. Eğer iAM kullanılıyorsa, bu zar konjonktivaya 8-0 vicryl sütürlerle tespit edilir (Resim 5f).^19,28,47

Literatürde LKHY’de KLEH nakli sonuçlarını değerlendiren prospektif özellikte ve uzun süreli takibi bulunan çalışmalara ait uygulamaların özellikleri Tablo 2’de özetlenmiştir.

Yeni Düzenlemeler

Günümüzde dünyada kullanımı giderek yaygınlaşan hücresel tedavi yöntemlerinin uygulanmasında yeni standardizasyonların geliştirilmesi kaçınılmazdır.⁴⁸ Ksenojenik (hayvansal kaynaklı) maddelerin kullanımı prion gibi bir takım hastalıkların bulaşına, tümörojenik etki oluşmasına veya immün reaksiyona yol açabildiğinden, KLEH prosedürlerinde, hayvansal ürünlerden arındırılmış yöntemlerin geliştirilmesi ihtiyacı ortaya çıkmıştır.^25,34,49,50 Ayrıca yine işlenmiş tıbbi ürünlerin insana nakli söz konusu olduğunda toplum sağlığını korumak adına bu uygulamaların, iyi laboratuvar uygulamaları altında yapılması gerekmekte olup ve bu gereklilik çoğu Avrupa ülkesinde yasallaştırılmıştır.^39,40,43,51

Türkiye’de de Sağlık Bakanlığı’nın İnsan Doku ve Hücreleri ile Bunlarla İlgili Merkezlerin Kalite ve Güvenliği Hakkında Yönetmeliği 27 Ekim 2010 tarihli resmi gazetede yayımlanmıştır.⁵²

Sonuç

Oküler yüzeye ait iyileşme ve homeostazın regülasyonu sürecinde epitelizasyonun sürekliliğini sağlayacak dinamik dengeler önem taşımaktadır. Bu dinamik dengelerin bozulması ile ortaya çıkan, görme yetisininin yanı sıra ağrılı ve yorucu bir süreç ile yaşam kalitesi azaltan LKHY’de çözüme yönelik temel ve klinik bilimlerin multidisipliner olarak yürüttükleri çalışmalar yoğun olarak sürmektedir. Oküler yüzey homeostazını oluşturarak enflamasyonu baskılayan, rejenerasyonu güçlendiren ve neovaskülarizasyonu inhibe eden hedefe yönelik etkili yöntemlerinin geliştirilmesinin cerrahi başarıyı arttırması beklenir. Bu amaçla, alınan kök hücrelerin üzerinde prolifere olacağı ideal taşıyıcı ve limbal mikro çevreyi tanımlama ve uygulama konusundaki gelişmelerin, KLEH içindeki kök hücre popülasyonunun sayı ve kalitesinde sağlayacağı iyileşme ile greft başarısını arttıracağını varsaymak günümüzde hayal olmaktan çıkmıştır. Oküler yüzey restorasyonunda, özellikle de otolog hücre kaynağının olmadığı bilateral olgularda, limbal kök hücre dışındaki kök hücre kaynaklarının (örneğin; indüklenmiş pluripotent kök hücreler) biyolojik davranış modelleri modifiye edilerek limbal kök hücreye dönüşebilirliğinin sağlanması ve doku mühendisliği tekniklerindeki gelişmeler ile bu karmaşık patolojinin tedavisinde yeni ufuklar açılması muhtemeldir.

Etik

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: Özlem Barut Selver, Ayşe Yağcı, Sait Eğrilmez, Dizayn: Özlem Barut Selver, Mehmet Gürdal, Utku Ateş, Sait Eğrilmez, Veri Toplama veya İşleme: Özlem Barut Selver, Ayşe Yağcı, Analiz veya Yorumlama: Özlem Barut Selver, Ayşe Yağcı, Sait Eğrilmez, Jose Mario Wolosin, Literatür Arama: Özlem Barut Selver, Mehmet Gürdal, Ayşe Yağcı, Melis Palamar, Yazan: Özlem Barut Selver, Ayşe Yağcı Sait Eğrilmez, Mehmet Gürdal, Melis Palamar, Türker Çavuşoğlu, Utku Ateş, Ali Veral, Çağrı Güven, Jose Mario Wolosin.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek almadıkları bildirilmiştir.