Öz

Doku mühendisliği (DM), biyoloji, mühendislik ve tıp bilimlerini biraraya getiren ve hastalık modellerinin geliştirilmesinden, ilaç geliştirme ve gen terapisi çalışmalarına ve hatta mühendislik yöntemleri ile geliştirilmiş hücresel veya doku temelli tedavilere imkan tanıyan bir bilim dalıdır. Gözün kolay ulaşılabilir ve mühendislik uygulamalarına yatkın bir organ oluşu, DM’nin oftalmolojideki yolunu açmıştır. Gözyaşı tabakası, göz kapağı, kornea, optik sinir, glokom ve retina hastalıklarını içeren geniş bir yelpazede DM çalışmaları yürütülmektedir. Alanındaki hızlı ilerleyen bilimsel gelişmelerle DM, oküler hastalıkların yönetimini kökten değiştiriyor gibi görünmektedir.

Giriş

Doku mühendisliği (DM), doku iyileşmesi, tedavi ve rejenerasyon için biyoloji, mühendislik, gelişimsel biyoloji ve tıp ve morfogenez bilimlerine dayanan bir disiplindir. DM, biyomühendislik, biyomedikal mühendisliği ve malzeme bilimleri ile birlikte hücreleri ve uygun fizyolojik faktörleri kullanarak hasarlı doku ve organları tedavi etmeyi, onarmayı veya değiştirmeyi amaçlamaktadır. DM çalışma alanları ayrıca hastalık modelleri geliştirme, hücreler için doku iskeleleri oluşturma ve aktif ilaç bileşenlerini dokulara ulaştırmayı kapsar.¹ Dokuların intrensek rejenerasyon potansiyelinin nasıl kontrol edileceği ve düzenleneceği bilgisi çok önemlidir.² Esas amaç, tıp ve yaşam bilimlerini desteklemek için yapay doku veya organ modelleri oluşturmaktır.

Göz dokuları epitelyal, mezenkimal, bağ ve nöral dokulardan köken alır ve yapısal ve fonksiyonel entegrasyonu hassas bir şekilde düzenlenir (Şekil 1). DM, kornea, gözyaşı bezi, retina, optik sinir ve glokom gibi hastalıklarla ilgili yukarıda belirtilen hedeflere ulaşmak için kullanılmıştır ve laboratuvardan tedaviye önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. DM’nin oftalmolojide kullanımı aşağıdaki başlıklarda toplanabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir:

a. Hastalık Modelleri

Hayvan modelleri, tür farklılıkları nedeniyle insan patojenik süreçlerini en iyi şekilde yansıtmayabilir.³ Mikroakışkan çipler, kök hücreler, hücresel sinyalizasyon ve biyomekanikteki son gelişmeler DM’de kilometre taşları olmuş ve çip üstü organ teknolojisi ortaya çıkmıştır.⁴ Mikroakışkan sistemler, yaşam koşullarında dokuların dinamik, fonksiyonel ve patofizyolojik özelliklerini göstermek için tasarlanmıştır. Mikroakışkan bir sistemde, doku iskeletini oluşturan biyomalzemelerin fizyolojik koşullara yaklaşan üç boyutlu (3B) bir yapı üretmek için yetiştirilen spesifik hücrelerin ekildiği cam veya polimerik malzemelerde özel olarak tasarlanmış kanallar oluşturulur. Bu gelişmiş mühendislik sistemleri, organların benzersiz mikro çevresini in vivo olarak oluşturmak ve in vitro hastalık modelleri oluşturmak için tasarlanmıştır.^{4, 5} Çip üstü organ sistemleri ile, belirli bir dokunun/organın (yani “tek organ sistemleri”) temel işlevleri veya tek bir sistem içindeki çoklu organların/dokuların etkileşimleri ve reaksiyonları (yani “çoklu organ platformları”) incelenebilir.

Son gelişmeler, insan hastalıklarını hastaya özgü indüklenmiş pluripotent kök hücrelerle (iPSC) modellemenin mümkün olduğunu göstermiştir.⁶ iPSC’ler, insan embriyoları kullanılmadan somatik bir hücre hattından üretilir ve herhangi bir somatik hücreye farklılaşabilir. Bu, hastalık patogenezini incelemek ve ilaç geliştirme çalışmaları yapmak için çok önemli bir araçtır (Şekil 2).⁷

Çip üstü organ mikroakışkan teknolojileri, temel oküler fizyoloji ve hastalık patogenezi hakkındaki anlayışımızı artırmıştır. İki boyutlu hücre kültürünün eksikliklerinin üstesinden gelerek, göz hastalıklarının tedavisi için klinik kullanıma uygun alternatifler ürünler geliştirilmesine olanak sağlarlar.⁸ Örnek olarak, mikroakışkan platformalar ile göz kırpma stresinin insan göz yüzeyi üzerindeki etkilerini incelemek için dinamik korneal epitel bariyerini kültürleri geliştirilmiş ve bu platformalar oftalmik ilaçların geliştirilmesine katkıda bulunmuştur.⁹ Benzer sistemler kornea epitelyal yara onarım sürecini değerlendirmek içinde uyarlanabilir ve kullanılabilir.¹⁰ Başka bir çalışmada, temel kornea fonksiyonlarını araştırmak ve topikal ilaç uygulaması hakkındaki çalışmaları kolaylaştırmak için primer fare kornea epiteli ve endotel hücreleri kullanılarak mikroakışkan 3B mikro-mühendislik çip üstü kornea geliştirilmiştir.¹¹

Glokom araştırmalarında, DM yaklaşımları 1980’lerin sonlarından beri trabeküler ağı (TM) yeniden oluşturmak için kullanılmaktadır. Üstüne insan TM hücreleri ekilen selüloz gözenekli filtreler, hidrojel kalıplar ve fotolitografi teknikleri, sertliğin gen ekspresyonu ve mekanotransdüserler üzerindeki etkisini, ilaçların TM üzerindeki etki mekanizmasını ve mevcut ilaçların yeni alanlarda kullanımını araştırmak için kullanılmıştır.¹² Ayrıca, dışa akış yapısı ve fonksiyonunun düzelip düzelmediğini görmek için hücresizleştirilmiş, DM ürünü bir ön segment göz kültürü TM hücreleri ekilerek transplante edilmiştir. Tasarlanan ön segment iskeleleri kullanılarak yapılan oküler perfüzyon kültürleri, dışa akış araştırmalarının yapılabilmesi için donörlerden gelecek gözlere bağımlılığı azaltmakta ve spesifik genotip ve fenotipler üzerinde çalışmalar yapmaya olanak sağlamaktadır.¹³ Biyomühendislik ürünü sentetik 3B in vitro TM modelleri, göz içi basıncı (GİB) düzenlemesinin mekanizmalarını detaylı araştırmak, glokom hastalığı modeli geliştirmek veya çok sayıda glokom ilacını hızla taramak için de kullanılabilir. Bunun için trabeküler mimariyi taklit edecek iskele ve ekstrasellüler matriks (ECM) bileşenleri için biyomalzemelerin seçilmesi ve tasarlanması gerekir.¹⁴

Glokom araştırmalarında retina ganglion hücreleri (RGH) ve bu hücrelerdeki dejenerasyonun değerlendirilmesi de gerekmektedir. Glokom hastalarının kanından veya derisinden iPSC üretmek ve bunları RGH’lere farklılaşmaya yönlendirecek DM yöntemleri, patogenez çalışmalarında değerli yaklaşımlardır.¹⁵

Öte yandan, iPSC’ler, farklılaştıktan sonra organoidler adı verilen minyatür organ benzeri yapılar oluşturan kendi kendine bir araya gelmiş 3B yapılar oluşturabilir. Organoidler, organların hücresel heterojenliği ve mimarisini sahip olabilir ve insan dokularının gelişim aşamalarını in vitro ortamda araştırmak için mükemmel araçlardır. Organoid araştırmalarına olan ilginin artması, oftalmolojide de yeni yaklaşımlar getirmiştir. iPSC kaynaklı retina organoidleri, stabil olmaları ve doğal retinaya benzerlikleri nedeniyle embriyonik gelişim, patolojik durumlar ve retina hastalıklarına yeni terapötik yaklaşımlar için 3B modeller oluşturmasına olanak sağlarlar.¹⁶ Lens, nöral retina ve retina pigmentli epitel (RPE) hücrelerinin yapıları, farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerden (EKH) kültür ortamında zaten üretilmiştir.¹⁷ Ayrıca, insan dış kan-retina bariyerinin 3B modelleri, kuru ve yaş tip yaşa bağlı maküler dejenerasyon (YBMD) fenotiplerinde sağlıklı RPE-koryokapillaris etkileşimlerinin kritik özelliklerini yansıtacak şekilde tasarlanmıştır.^{18, 19}

Optik sinir başı (OSB) hastalığı modelleri henüz geliştirilememiştir çünkü OSB’nin sistem biyolojisi tanımı ve glokomda büyük ölçekli gen ekspresyonu ve fenotip verileri eksiktir, astrositik ve astrositik olmayan ECM hücrelerinin doku yeniden modellenmesindeli rolleri tam olarak bilinmemektedir ve GİB’nin OSB’de dokular üzerindeki gerçek etkisi hakkında bilgiler yeterli değildir.²⁰ Bununla birlikte, iPSC kaynaklı glokomatöz RGH’lerde mitokondriyal yetmezlik olduğu gösterildiğinden, hastalık sürecini tersine çevirmek için mitokondriyal biyogenezin iyileştirilmesi araştırılabilir.²¹ Birden fazla organoid türünün birleştirilmesi, assembloid adı verilen daha karmaşık hücresel yapılar ortaya çıkarır. Çeşitli dokulardan oluşan gelişmiş in vitro modeller, fonksiyonel sonuçları destekleyen ve iyileştiren daha doğal bir ortama benzemektedir.

b. İlaç Geliştirme Çalışmaları

DM, genellikle insan fizyolojisini yeterince yansıtmayan, çok eleştirilen ve pahalı hayvan deneylerine olan ihtiyacı azaltan ön ilaç taramaları için bir araç sağlar.¹ Gerçekten de, 2022’de FDA Modernizasyon Yasası 2,0 ile insanlara verilmeden önce yeni geliştirilen ilaçların hayvan testinde geçmesi gerekliliği kaldırıldı. Yeni yasa hayvan testlerini yasaklamasa da, ilaçların organ işlevini taklit eden mikroçipler üzerinde test edildiği yapay zeka ve çip üstü organ teknolojisi gibi yeni teknolojilerin kullanımına izin vermektedir. Hayvan modellerinde çoğu ilaç ve toksisite deneyinin yerini çip üstü organ modellerinin alması beklenmektedir.²²

Bennet ve ark.²³, göz damlası taşınmasını araştırmak için bir mikroakışkan sistemde ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücrelerini büyüterek bir “kornea epiteli çipi” geliştirmişlerdir. Başka bir dinamik mikro mühendislik ürünü insan kornea sistemi de in vitro ilaç emilim çalışmaları için kullanılmıştır.²⁴ Normal ve patolojik oküler anjiyogenez çalışmalarında ve antianjiyojenik ilaçların test edilmesinde in vitro 3B vasküler ağ rekonstrüksiyonu için bir mikroakışkan plastik bazlı çip kullanılmıştır.²⁵

İlaç yeniden konumlandırma, başka hastalıklar için onaylanmış ilaçlar için yeni kullanım alanları belirlenmesi yaklaşımıdır. Mevcut medikal ajanların moleküler etki mekanizmaları ve farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri, farmakolojik hedefleri açısından araştırılarak yeni alanlardaki kullanımları araştırılır. Bu ilaçların güvenliği ve etkinliği zaten bilinmektedir, bu da zamandan ve maliyetten tasarruf sağlar. DM yaklaşımı gerektiren bazı ilaçların yapısal modifikasyonu, yeni ilaç taşıyıcı sistemi geliştirilmesi veya diğer ilaçlarla kombinasyonu gerekli olabilir. Kontrollü ilaç salım sistemlerinin geliştirilmesi de mümkündür.

Oftalmolojide siklosporin A (SsA) kullanımının evrimi, başlı başına bir ilaç yeniden konumlandırma örneğidir. SsA ilk olarak 1970’lerde antifungal bir ajan olarak geliştirildi ve sonuçlar hayal kırıklığına neden oldu. Güçlü immünosüpresif anti-T-hücre etkisi ve kemik iliği toksisitesinin olmaması nedeniyle solid organ transplantasyonu cerrahisinde yaygın olarak kullanıldı. Sistemik SsA, enfeksiyöz olmayan üveitte de kullanıldı. Topikal SsA ilk olarak 1980’lerde deneysel korneal allogreft reaksiyonlarını inhibe etmek için kullanılmıştır. Kuru göz sendromunda SsA’nın yararlı etkilere sahip olduğu ilk olarak köpeklerde gösterilmiştir.²⁶ Topikal SsA, Sjögren sendromlu hastalarda lokal immünosüpresif bir etkiye sahiptir ve hem konjonktival epitelde hem de substantia propriada CD4+ hücrelerinde anlamlı azalmaya neden olur.²⁷ Günümüzde, kuru göz sendromu ve çeşitli enflamatuvar gözyaşı bezi ve oküler yüzey hastalıkları için ana tedavi seçeneklerinden biridir.²⁸

Glokom araştırmalarında, ilacın yeniden konumlandırılması en aktif alanlar arasındadır.¹⁵ Araştırılan ilaçlar, oküler vasküler düz kasların vazodilatasyonuna neden olabilecek kolinerjik ilaçlardan nifedipine kadar uzanmaktadır.²⁹ GİB düşürücü ilaçlara ek olarak, antiepileptik bir ilaç olan valproik asit glokom cerrahisinde adjuvan ilaç olarak konumlandırılmıştır. Valproik asit, ameliyat sonrası konjonktival yara iyileşmesinde kolajen üretimini azaltır ve kolajen lif organizasyonunu bozar; böylece, anti-fibrotik aktivitesi başarıyı artırabilir ve fonksiyonel belblerin hayatta kalmasını sağlayabilir.³⁰

Retinitis pigmentoza (RP), YBMD ve diyabetik retinopati de yeniden konumlandırılmış ilaçlar kullanılarak tedavi edilebilir. Tüm nörodejeneratif hastalıklarda, apoptotik hücre ölümüne yol açan ortak sinyal yolları arasında kalsiyum eksitotoksisitesi, oksidatif stres, mitokondriyal disfonksiyon ve nöroenflamasyon yer almaktadır. Bu ana patojenik mekanizmaların hedeflenmesi, depresyon ve epilepsi gibi kronik hastalıkları başarılı bir şekilde tedavi etmiştir. Yeniden konumlandırılması olası ilaç listesinde brimonidin, kurkumin, seftriakson, MitoQ ve valproik asit gibi ilaçlar yer almaktadır.³¹

Kuru tip YBMD’de görme kaybı çoğunlukla RPE dejenerasyonundan kaynaklanır ve kısmen enflamasyondan kaynaklanır. FDA tarafından klinik depresyonun tedavisi için onay alan fluoksetin, RPE hücrelerinde enflamasomların aktivasyonunu ve enflamatuvar sitokin salınımının inhibe eder. Gerçekten de, iki sağlık sigortası veritabanında yer alan 100 milyondan fazla Amerikalı hastanın verilerinin analizi, fluoksetin ile tedavi edilen klinik depresyonlu hastalar arasında kuru YBMD gelişme riskinin azaldığını ortaya koymuştur, bu da fluoksetinin kuru YBMD için potansiyel bir ilaç yeniden konumlandırma adayı olduğunu düşündürmektedir.³²

Başka bir yeniden konumlandırılan ilaç, anti-enflamatuvar, immünomodülatör ve antioksidan etkileri nedeniyle  psöriasis ve multipl sklerozun tedavisi için onay almış olan dimetil fumarattır (DMF). Diyabetik retinopati ve YBMD gibi gözün vasküler hastalıkları, nükleer faktör (eritroidden türetilmiş-2)-benzeri 2 (Nrf2) aktivitesinde azalma ile ilişkili ortak bir patogeneze sahiptir. DMF, fotoreseptörlerin, RGH’lerin ve RPE’nin korunmasına ek olarak Nrf2 yolağı ve ilgili hedef genlerin indüksiyonuna neden olur. DMF’nin YBMD, otoimmün üveoretinit, kistoid maküla ödemi, glokom, keratit, optik nörit, optik sinir travması ve retina iskemisinde kullanımı hakkında in vivo kanıtlar artmaktadır. Topikal DMF uygulaması, oküler patolojilerde yeniden konumlandırılması açısından incelenmelidir.³³

Mikroakışkan sistemler ayrıca emülsifiye olabilen ve in vivo olarak enflamasyona neden olabilen izopropanol silikon yağı gibi cerrahi intraoküler tamponadları test etmek için de kullanılmıştır. Bir in vitro “çip üstü göz” mikroakışkan sistemi kullanılarak, polimer silikon yağının ayrışmayı ve emülsiyon damlacıklarının oluşumunu önlediği gösterilmiştir.³⁴

Topikal tedaviler, ilacın sadece küçük bir bölümünün oküler dokulara ulaşmasına izin verir. Kontrollü salımlı oftalmik ilaçların geliştirilmesi, ilaç dağıtımının etkinliğini artırmayı ve hastaların göz damlası damlatma sayısını azaltmayı amaçlamaktadır.³⁵ İlaç yükleme ve kontrollü salım yapabilen biyouyumlu ve biyobozunur polimer partiküller sayesinde non-invaziv ilaç dağıtımını mümkündür. Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) sıklıkla kullanılan biyobozunur bir malzemedir.³⁶ Örneğin; adheziv bir ortamda süspanse edilen polimer iyon değiştirici reçine parçacıkları ile birleştirilen anti-glokomatöz betaxolol veya diğer beta-blokerler, gözde daha yavaş ve daha uzun süre salınır (Japonya patent no: JPH0725698B2 - “Formulation for the treatment of glaucoma with sustained release and comfortable application”). Mikroakışkan çip çalışmaları sayesinde tek tip ve partikül boyutu kontrol edilebilir, yüksek miktarda ilaç yüklenebilen ve uygun degredasyona sahip polimer partiküllerinin hazırlanmasına mümkün olabilir. Yapılan böyle bir çalışmada, latanoprost ve deksametazon monodisperse biyobozunur ~150 µm çapında PLGA’ya yükleyerek çoklu ilaç polimer partikülleri hazırlanmış ve ilaç salım parametreleri kontrol edilerek ve optimizasyon çalışmaları yapılmıştır.³⁷ Ayrıca, yüksek biyoyararlanıma sahip ilaç nanosüspansiyonları hazırlanabilir. Bunlar, süspanse edilen ve polimerler veya yüzey aktif maddeler tarafından stabilize edilen mikron boyutlu ilaç parçacıklarıdır. Örneğin; basit bir mikroakışkan nanopresipitasyon yöntemi ve nanokristalizasyon teknolojisi kullanılarak bir oftalmik hidrokortizon nanosüspansiyonu oluşturmak, etki süresini önemli ölçüde uzatmıştır.³⁸

Mikroakışkan teknolojisinin mevcut teknolojilerle birleştirilmesi, kontrollü in vitro ilaç dağıtımı çalışmalarının yapılmasını sağlayabilir.³⁹ Hassas oftalmik ilaç dağıtımı cihazları, göz enfeksiyonlarını tedavi etmek veya uzun süreli steroid salımı yapmak için bir araç olarak kullanılan kontakt lensler gibi mekanik, elektronik ve mikroakışkan işlevlere sahiptir.⁴⁰ Biyomalzemelerin kompozisyonunu kontrollü ilaç salınımına izin verecek şekilde ayarlamak çok önemlidir.⁴¹

Oftalmolojide in vitro ilaç salımı çalışmaları esas olarak statik koşullar altında gerçekleştirilir ve gözyaşı hacminin akış dinamiklerinin etkisi dikkate alınmaz. Çeşitli ticari kontakt lenslerden flukonazol salınımını araştırmak için göz kapakları olan bir in vitro 3B baskı göz modeli geliştirilmiştir.⁴² Bu model gözyaşı hacmi ilaç salınımını önemli ölçüde hızlandırdığından, fizyolojik gözyaşı hacmini simüle etmek için tasarlanmıştır.⁴³ Başka bir mikroakışkan ünite, gözyaşlarının hacimsel akış hızını simüle etmek için tasarlanmıştır.⁴⁴ Diklofenak salınım kinetiği, dinamik koşullar altında statik koşullara göre daha yavaş bulunmuştur. Ayrıca, hidrofilik akrilik veya silikon bazlı hidrojel materyallerin moksifloksasin ile plazma destekli greftleme ile yüzey modifikasyonu, in vitro diklofenak salım süresini anlamlı düzeyde ve on günden fazla uzatmıştır.⁴⁵

c. Gen Terapileri

Gen terapileri, DNA ve RNA gibi genetik materyalin ve hatta bazı durumlarda proteinlerin uygulanması yoluyla hücresel işlevi değiştirmeyi amaçlamaktadır. Uygulama in vivo olarak veya vücuttan çıkarılan, ex vivo koşullarda transfekte edilen ve daha sonra organizmaya tekrar verilen hücreler ile gerçekleştirilebilir.

Kornea, klinik olarak erişimi kolay bir dokudur ve immün açıdan ayrıcalıklı durumu gen tedavileri için avantaj sağlar. Bu nedenle kornea gen tedavileri bir veya birden çok geni içeren gen tedavilerinin adeno-ilişkili virüs (AAV) ve nanoparçacıklar yoluyla uygulanmasına odaklanmıştır. Düzenli Aralıklı Palindromik Tekrar Kümeleri (“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Associated Systems”, CRISPR/Cas9) gibi gen düzenleme yöntemlerinin olası kullanım alanları artmaktadır.⁴⁶ Endotel hastalıkları için gen modülasyon tedavileri, erken evre hastaların tedavisini mümkün kılarak kornea allogreftlerine olan ihtiyacı azaltabilir.⁴⁷

Arka segment ile ilgili olarak, AAV vektörleri ile modifiye gen tedavisinin, RGH sağkalımını ve akson rejenerasyonunu artıran etkili bir nöroprotektif ve rejeneratif tedavi olduğu gösterilmiştir.⁴⁸ Voretigene neparvovec (Luxturna; Sparks Therapeutics), insan RPE65’in modifiye edilmiş bir transgenini taşıyan, replike olamayan bir AAV-2 vektörü içerir. RPE65’in bialelik patolojik mutasyonu ile ilişkili distrofilerin tedavisi için onaylanmış tek gen tedavisidir⁴⁹ ve tüm RP hastalarının %1’ini oluşturan bu hastaların tedavisi için onay almıştır.⁵⁰ RPE65 geni, A vitamininin görme döngüsü metabolizmasından sorumludur ve mutasyonları Leber konjenital amorozis olgularının yaklaşık %6’sına neden olur. Faz III klinik çalışmasına, tanısı doğrulanmış bialelik RPE65 mutasyonu olan hastalar dahil edilmiştir. Tedaviden sonra ciddi yan etkiler ile karşılaşılmamış ve görmede anlamlı iyileşme sağlanmış ve 3-4 yıllık takipte bu iyileşme korunmuştur.^{51, 52} Subretinal enjeksiyon, etkinliği daha yüksek ve sistemik etkisi daha az olduğu için intravitreal enjeksiyona göre tercih edilen en yaygın kullanılan tekniktir.^{53, 54} Bununla birlikte, tedavi edilen alan, subretinal enjeksiyonun etrafındaki retina dekolmanı ile sınırlıdır.

d. Biyomalzemelerin Geliştirilmesi

DM’nin amaçlarından biri, hücrelerin etkileşime gireceği uygun biyomalzemeler geliştirmektir. DM’de kullanılan biyomalzemeler, biyouyumluluk, yapısal stabilite, mekanik dayanıklılık, hücresel entegrasyona izin verecek porozite, hedeflenen dokuda klinik uygulanabilirlik ve toksisite, antijenisite ve mutajen olmaması gibi belirli kriterleri karşılamalıdır.^{55, 56} Oftalmolojide şeffaflık da önemlidir. Ayrıca, materyaller enflamatuvar bir reaksiyonu uyarmamalı ve potansiyel olarak rejenerasyona ve iyileşmeye yardımcı olmalıdır.

Korneanın yüksek kırılma gücü ve optik açıdan şeffaf olmasına rağmen çekme mukavemetine yüksek olması nedeniyle karmaşık bir yapısı vardır ve kornea mimarisini tek tip doğal veya sentetik biyomateryal kullanarak elde etmek zordur.^{57, 58} Kornea ile ilişkili DM stratejilerinde öncelikle kolajen, jelatin, kitosan, amniyotik membran ve ipek gibi hammaddelerin yanı sıra polivinilalkol (PVA) ve polietilen glikol (PEG) türevleri gibi sentetik yapılardan yararlanılmaktadır. Kolajen gibi doğal biyomalzemelerin biyouyumluluğu yüksektir ve jelatinin avantajı ucuz olmasıdır, ancak mekanik özellikleri standartlara uygun değildir. Hücresizleştirilmiş kornea, doğal korneaya benzer özelliklere sahiptir, ancak biyoaktivite düzeyi düşüktür. Kitosan, basit biyofonksiyonelleştirme, iyi biyouyumluluk ve yönetilebilir biyobozunurluk sunar. Ancak, diğer malzemelerle çapraz bağlanmalıdır. Sentetik biyomalzemelere gelince, PVA ve PEG diakrilatın (PEGDA) mekanik özellikleri kontrol edilebilir, ancak her ikisi de korneal DM için ek bileşenlere ihtiyaç duyar. Kollajen veya amniyotik membran, biyouyumlu bir biyomateryal olarak PVA veya PEGDA ile birleştirilebilse de, birlikte enflamatuvar yanıtı indükleyebilirler. Kitosanın PVA veya PEGDA ile birleştirilmesi, uygun mekanik özelliklere ulaşılmasına olanak verse de degredasyon oranında doğal orandan düşüktür.⁵⁹

3B biyobaskı, biyomalzemeler ile hücrelerin eşzamanlı işlenmesi ile yapay hedef doku iskeleleri oluşturmak ve doğal embriyogenetik doku oluşumunu taklit etmek için kullanılabilen bir teknolojidir.^{60, 61} Akıllı lif hizalama ile, korneal DM için keratosit migrasyonu ve oryantasyonu çalışılabilir.⁶² Geleneksel 3B yazıcı kartuşları biyomürekkep ile doldurulabilir.⁶³ Bir 3B yazıcıdaki ekstrüzyon tabanlı yöntem, daha iyi mekanik özellikler elde etmek için en iyi yöntem gibi görünmektedir. Bununla birlikte, damlacık bazlı yöntem ile elde edilen mikro yapı, geometrik eğrilik ve esneklik katsayısı daha iyi olabilir.⁶³

Kornea iskelelerinin geliştirilmesinde nanoteknoloji kullanılması hücre adezyonu, proliferasyonu ve farklılaşmasını teşvik edebilir ve kornea iskelesinde gaz, besin ve atık alışverişini kolaylaştırabilir.^{64, 65} Kornea endotel hücrelerinin (KEH) olgunlaşması ve büyümesi için biyobozunur bir iskele oluşturan kitosan nanoparçacıkları/polikaprolakton membranlarında olduğu gibi ekilen kök hücrelerin işlevselliğini artırmak mümkündür.⁶⁶ Nanoteknoloji, hasarlı kornea için kişiselleştirilmiş rejeneratif tedavileri mümkün kılabilir.⁶⁷

Korneal DM’nin yanı sıra, ilk kez 2020 yılında biyobaskı teknolojisi ile adipoz doku kökenli mezenkimal stromal hücrelerle kaplanan ve meibositler yerine lipid salgısı için sebositler ekilen polikaprolakton kullanılarak tarsal plaka iskeleleri üretilmiştir.⁶⁸ Bu teknoloji, tümör invazyonu veya travma kaynaklı büyük göz kapağı defektlerinin tedavisi için bir alternatif sağlayabilir.

Retina, biyobaskı çalışmalarında en sık çalışılan ikinci göz dokusudur. Retina progenitör hücreleri (RPH) için 3B baskı ile iskele üretilebildiği 2017 yılında gösterilmiştir.⁶⁹ Kimyasal olarak modifiye edilmiş hiyalüronik asit hidrojelleri ve bir Bruch membranına benzer özellikte bir malzeme sentezlenmiştir.^{70, 71} RGH ve glial hücreler bu iskele üzerine başarılı bir şekilde 3B olarak basılmıştır. Hücreler canlı kalarak stabil bir fenotip sergilemişlerdir.⁷² Glial hücreler basılan hücreler için bir substrat olarak kullanıldığında, RGH nörit büyümesi anlamlı düzeyde artmıştır.⁷³ Karmaşık bir retina yapısı 3B olarak basılabildiğinde retina hastalığı modelleri geliştirilmiş olacaktır. Örnek olarak, YBMD’de RPE’ye bağlı koroidal fenotipi araştırmak için bir 3B baskı dış kan retina bariyeri dokusu (yani RPE, Bruch membranı ve koryokapillaris) oluşturulmuş ve incelenmektedir.⁷⁴ Müller hücresi tabanlı bir 3B biyomimetik model de biyobaskı ile elde edilmiştir ve in vivo diyabetik retina modelinde gözlemlendiği gibi hiperglisemik koşullar altında benzer tepkiler vermiştir.⁷⁵

e. Doku Mühendisliği Ürünü Hücrelerin, Dokuların ve Doku Eşdeğerlerinin Transplantasyonu

DM’nin bir alt dalı olan hücre tedavileri, oküler hastalıkların tedavisinde çok umut vericidir.⁷⁶ Kök hücreler, plastisiteleri, farklı hücre tiplerine dönüşme sinyali gelene kadar diferansiye olmamaları ve kendi kendini yenileyebilme kapasiteleri nedeniyle yaygın olarak kullanılır.⁷⁷ EKH’ler, bölünme yoluyla çoğalabilen ve üç primer germ hücresine dönüşebilen pluripotent kök hücrelerdir. Bununla birlikte, EKH’ler immün yanıta neden olabileceği ve reddedilebileceğinden, iPSC’ler bu hücrelere alternatif olarak kullanılır.

Hücre tedavisinin başarısı, hücreler hazırlanırken uygun DM yöntemlerinin kullanılmasına ve hücrelerin tam olması gereken lokusa migrasyonu ve yerleşmesini sağlayacak biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlara bağlıdır.⁷⁸ Nakledilen hücrelerin işlevsel olması için, hücreler yeni sinaptik bağlantılar oluşturmalı ve konak ile bütünleşmelidirler.⁷⁹ İnsan keratositleri gibi bazı hücre tipleri, standart kültür teknikleri kullanılarak kolayca çoğaltılabilir.⁸⁰ Ancak arka segmente, hücre hattı transferi ve transplantasyonu için erişim zor olabilir. Göz elektrik tabanlı bir organdır; retina hücreleri endojen elektrik akımları kullanarak işlev görürler.⁸¹ Elektriksel stimülasyon, nakledilen hücrelerin göçünü, aksonal rejenerasyonu ve sinaps oluşumunu olumlu etkileyebilir.⁸²

Son çalışmalar, biyolojik doku veya doku eşdeğerlerine artan ihtiyacı karşılamak için otolog veya immünolojik açıdan eşleşen kök hücrelerin kullanıldığı DM yöntemleriyle klinik olarak uygun boyutlarda yapay organlar geliştirmeye odaklanmıştır.¹ Organogenez ve gen ekspresyonları, kök hücre biyolojisi ve DM teknolojileri hakkındaki mevcut bilgi birikimi ile rejeneratif tıp ortaya çıkmıştır. Bu, hastalığın ilk aşamalarında organdan sağlıklı hücrelerin izole edilmesini, bu hücrelerin in vitro ortamda çoğaltılmasını ve doku iskeletine ekilmesini içerir. Organogenez için vital koşullar sağlanır ve laboratuvar ortamında fonksiyonel doku elde edilir. Hastalık süreci ilerledikçe, hasarlı organın yerine yapay organ nakledilir. EKH ve iPSC’lerin rejeneratif tıpta olası kullanımı hakkında ilk başta çok heyecan duyulmasına rağmen, gerçekte insanda kullanım örnekleri sınırlı kalmıştır.

Biyosentetik bir iskelenin hücre kültüründen türetilmiş hücrelerle birleştirilmesi, tamamen biyomühendislikle üretilmiş bir kornea üretilmesine olanak sağlayabilir. Korneal DM’de iki ana yaklaşım kullanılmıştır. Bunlar, doku kültürü ile istenen hücre popülasyonunu çoğaltmak veya baştan oluşturmak veya doğal kornea hücrelerinin endojen kornea rejenerasyonunu uyarmasını sağlayan bir biyomimetik/biyosentetik araçlar kullanarak kornea yapısını desteklemektir. Birinci yaklaşımda, kornea hücreleri ile hazırlanan doku kültürü bir tabaka olarak nakledilebilir veya hücreler ayrıştırılır ve ön segmentin istenen bölümüne enjekte edilebilir.

Bu biyomühendislik ürünü kornealar, bir kornea greftini yapılamayan patolojik gözlerde kullanılan tamamen yapay kornealardan (yani keratoprotezlerden) farklıdır. Günümüzde mevcut keratoprotezlerin hiçbiri konak dokuile sorunsuz bir şekilde bütünleşmemektedir⁸³ ve hiçbir keratoprotez reinnervasyon sorununu çözememektedir.⁸⁴ Biyoentegrasyon ve biyoişlevselliği yüksek ve minimum komplikasyon oranlarına sahip yumuşak yapay kornea arayışı devam etmektedir.⁸⁵ Görmenin restorasyonu ihtiyacının yanı sıra biyoentegrasyon, epitelyal aşırı büyüme ve duyusal innervasyon çok önemlidir.⁸⁶ Sitotoksik olmayan, biyosentetik kompozitlerin gücü ve optik saydamlığı kontrol edilebilir. İleride, DM kornea eşdeğerleri donör kornea bulunma sorununu ortadan kaldırabilir.⁸⁷

Bir yapay kornea ürününden özellikle bahsetmek gerektiğini düşünüyoruz. CorNeat keratoprotezleri biyoentegrasyonu kolaylaştıran sentetik polimerik bir iskeleye sahiptir. Merkezi bir poli(metil metakrilat) optik ve insan ECM’lerinin mikro yapısını taklit eden entegre bir etekten oluşur. DM’de kullanılan iskele ve diğer kolajen matrislerinden farklı olarak mekanik dayanıma sahiptir ve yıkılabilir değildir. EverMatrix^TM, insan fibroblastları için doğal bir yaşam alanı oluşturacak özelliklerde optimize edilmiştir, migrasyon kolonizasyonunu ECM sentezini uyarır. İlk hayvan çalışmalarında biyoentegrasyonun gerçekleştiğini doğrulayan sonuçlar elde edildi⁸⁸ ve insana implantasyonu sonrası orta vadeli sonuçlar iyi bulundu.⁸⁹

Korneal stroma rejenerasyonu için kemik iliği mezenkimal kök hücreler (MKH), adipoz doku kaynaklı yetişkin MKH’ler, umblikal MKH’leri ve EKH’ler ve iPSC’ler kullanılmıştır. Bu hücreler oküler yüzeye implate edilmiş, tek başlarına veya biyobozunur, biyobozunur olmayan veya desellülerize kornea stroması iskelesi ile intrastromal olarak implante edilmiş, ön kamaraya veya intravenöz olarak enjekte edilmiştir. MKH bankalarından alınan kök hücreler otolog veya heterolog olabilir. MKH eksozomları bile stromal skar boyutunu azaltmak için immünosüpresif ve hasar onarıcı etkileri için kullanılmıştır.⁹⁰

Limbal kök hücre yetmezliğinin tedavisinde yetişkin limbal kök hücreleri in vitro olarak çoğaltmayı ilk deneyen Rama ve ark.⁹¹ olmuştur. Kültürdeki kök hücreler, ABCG2 gibi kök hücre markerlarını eksprese eden, sitokeratin 3 gibi hücre farklılaşma markerları için negatif olan ve yüksek nükleus/sitoplazma oranına sahip küçük hücreler olarak tanımlanır. DNp63a ekspresyonunun yüksek olması, başarılı transplantasyon için bir kalite kontrol göstergesidir.⁹¹ Transplantasyon yapılacak konakçı ortamının daha uyumlu olmasını gerektiren katı hasta dahil etme kriterleri klinik başarı için çok önemlidir.⁹² Ex vivo kültürlenmiş limbal epitel hücreleri dışında farklı hücre tedavileri de tanımlanmıştır. Bunlar arasında kültürlenmiş oral mukozal epitel hücreleri, ekstraoküler MKH’ler ve iPSC kaynaklı limbal kök hücreler yer alır.^{93, 94, 95}

Kornea endotel hastalıklarının tedavisi için çoğaltılmış yetişkin veya kök hücre kaynaklı KEH’ler çalışılmıştır.⁴⁷ KEH’ler, çoğalmak için uyarılması gereken durağan (“quiescent”) hücrelerdir. Aynı zamanda, miyofibroblastik fenotip ve hücresel fonksiyon kaybına yol açabilecek endotelyal-mezenkimal geçişten kaçınmak gerekir. iPSC’leri KEH’ye diferansiye etmenin alternatifi, sonuçta elde edilecek hücrelerin KEH’lere benzer özelliklere sahip olduğundan emin olunmasını sağlayacak katı protokollerin geliştirilmesidir.⁴⁷ Bu hücreleri veya aselüler endotelyal greft eşdeğerlerini uygulama stratejileri, allogreft ameliyatlarına olan ihtiyacı hafifletmek için araştırılmaktadır.⁴⁷

Bu arada, lakrimal bez dokusunu onarmak için, epitelyal hücre adezyon molekülü pozitif progenitör hücrelerin enjeksiyonunun yapılabileceği gösterilmiştir.⁹⁶ Sağlıklı ve aköz eksikliği kuru göz hastalığı olan farelerin lakrimal bezlerinden kültürlenen lakrimal bez kök hücreleri, progenitör hücre belirteçlerini (örneğin; Krt14, Krt5, P63, nestin) eksprese eder,⁹⁷ kendi kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve in vitro ve in vivo olarak asiner veya duktal hücre benzeri hücrelere dönüşebilirler.⁹⁸ Aksine, insan iPSC’lerinin gelişimsel sürecindeki belirteçleri indükleyerek doğrudan yeniden programlama yönteminin kullanıldığı bir 3B DM tekniği ile in vitro ve in vivo embriyogenez sonucunda salgı bezi yapısı yeniden oluşturulmuştur.⁹⁹ Kısmen hasar görmüş lakrimal bezin in situ rejenerasyonu, glandüler dokuda kök hücreler kullanılarak mümkündür. DM yöntemleriyle iPSC’lerden geliştirilen organoidler total glandüler hasar gelişen olgularda transplante edilebilir.¹⁰⁰ Gerçekten de, nöro-ektodermal kökene sahip iPSC’lerden organoid üretimi, lakrimal bezlere özgü asiner, duktal ve miyoepitelyal yapılar oluşturur ve salgı fonksiyonu gösterir.¹⁰¹

Retinal kök hücre tedavisi için retinal organoidler yararlı bir kaynak gibi görünmektedir.^{77, 102} RPH, gebeliğin 16. ve 20. haftaları arasında fetüsün nöral retinasında bulunan, mitotik kapasiteye sahip multipotent kök hücrelerdir.¹⁰³ RPH hücreleri in vitro ortamda yönlendirilirse fotoreseptör belirteçlerinin eksprese edebilir, retinanın nöronal hücrelerine farklılaşabilir,¹⁰⁴ ve yetişkin farelerde hem sağlıklı hem de dejeneratif retinanın dış nükleer katmanına entegre olabilirler.¹⁰⁵ Biyokimyasal olarak yönlenmiş ancak henüz morfolojik olarak farklılaşmamış progenitörlerin doğru zamanda seçilmesi en iyi sonucu verir.¹⁰⁶ Rod hücre gelişiminin zirvesindeki RPH’ler transplante edildiğinde rod fotoreseptörlerine farklılaşabilir ve sinaptik bağlantılar oluşturarak dejenere retinaya entegre olabilirler.^{106, 107} RPH’ler subretinal veya intravitreal olarak transplante edilebilir. Ancak, MKH’ler ile yapılan işlemlerde olduğu gibi, subretinal implantasyon teknikleri risksiz değildir.¹⁰⁸ Klinik olarak, Stargardt maküler distrofisi, kuru YBMD, RP ve muhtemelen retinal vasküler hastalıklarda EKH’lerden yararlanılabilir.^{109, 110}

Hasarlı RPE’nin sağlıklı iPSC’lerle değiştirilmesi hastalığın ilerlemesini geciktirebilir.^{111, 112} Allojenik veya otolog RPE hücrelerinin veya tabakalarının transplantasyonu yapılmıştır.¹¹³ Bir domuz modelinde, atrofik retinaya enjekte edilen iPSC kaynaklı RPE hücrelerinin tipik morfolojilerini, RPE ile ilişkili gen ekspresyonunu ve fagositik yeteneklerini koruduğu bildirilmiştir.¹¹⁴ Kombine RPE ve retina tabakası transplantasyonu ile dejenere retinanın tamamen değiştirilmesi mümkün olabilir.¹¹⁵

RP tedavisi için diğer kök hücreler de çalışılmıştır. Bunlar arasında kemik iliği kök hücreleri, konjonktival MKH’ler ve insan iPSC hücreleri kaynaklı retina hücrelerinin farelerde kullanımı da yer almaktadır.^{50, 116, 117, 118} İn vivo hayvan çalışmaları, MKH’lerin vitreusa transplantasyonunun RP’de fotoreseptör sağkalımını iyileştirebileceğini göstermiştir.¹¹⁹

Glokom ve diğer optik nöropatiler, RGH replasman tedavisinden yarar görmesi beklenen en yaygın hastalıklardır.¹¹⁰ Ancak, donör nöron sağkalımı ve retinal entegrasyon sorunları göz önünde bulundurulmalıdır. İnsan iPSC hücreleri RGH’lere farklılaştırılabilir ve hizalanmış nanofiber matrisler in vitro optik sinir benzeri model olarak kullanılarak iPSC kaynaklı RGH’lerin aksonal büyümesi yönlendirilebilir. Kolinerjik bir ilaç olan forskolinin de RGH farklılaşmasını teşvik ettiği bilinmektedir.¹²⁰ Donör sağkalımı, dendritik tabakalaşma, topografik dağılım ve donör-konak etkileşimlerini araştıran çalışmalarda kullanılan ex vivo insan RGH transplantasyonu protokolleri bildirilmiştir ve sonuçlar gelecekteki uygulamalar için umut vaat etmektedir.^{121, 122, 123} İnsan iPSC hücreleri in vitro olarak matür, fonksiyonel RGH’lere farklılaştırılıp farelere intravitreal olarak verildiğinde bu hücrelerin retina lokalizasyonu, morfolojisi ve işlevselliği doğal RGH’lere benzer bulunmuştur.¹²⁴ Nörotrofin-3’ü aşırı eksprese eden Schwann hücreleri ekilen domuz hücresizleştirilmiş optik sinirinin fonksiyonel bir iskele görevi gördüğü ve rejenere olan aksonlarının uzamasını ve remiyelinasyonunu desteklediği ve bu nedenle başarılı bir in vivo omurilik hasarı modeli olduğu gösterilmiştir.¹²⁵

Öte yandan, Wharton jölesinden türetilen MKH’lerin (WJ-MKH) nöronal transformasyonu değil ancak sekretuvar eksozomlarının etkileri araştırılmıştır.¹²⁶ Mitokondriyal adenozin trifosfat sentezini artırdığı ve nöroenflamasyonu baskıladıkları bilinmektedir.^{127, 128} Umbilikal kord WJ-MKH tedavisi, olaydan hemen sonra yapılırsa toksik optik nöropatiler ve neden olan mutasyonlardan bağımsız olarak RP için önerilmiştir.^{129, 130}

3B Mikro Dokular

3B kültür sistemleri hücre-hücre etkileşimini artırmayı ve doğal ortama benzer mikro çevre oluşturmayı, böylece doku fizyolojisine eşdeğer bir ortam yaratmayı amaçlamaktadır. Hücresel sferoidler veya 3B mikromimariler, yerçekimi kuvveti nedeniyle doğal olarak damlacık şekilde veya kalıplar içinde agrege olabilir veya fotolitografi, damlacık mikroakışkanları veya biyobaskı gibi biyomühendislik platformları kullanılarak oluşturulabilir.^{131, 132, 133} Oküler yüzey hastalıklarını tedavi etmek için konjonktival kök hücrelerden enjekte edilebilir oftalmik mikro dokular üretilmiştir.¹³¹ 3B dinamik kültür yöntemleri yapıların kök hücre özelliklerini korumasını ve oküler farklılaşmasını kolaylaştırmasını sağladı. Hirayama ve ark.¹³⁴, epitelyal ve mezenkimal hücrelerden oluşan bir mikrogermden biyomühendislik ile fonksiyonel bir fare lakrimal bezi üretmeyi başarmıştır. Ortotopik implantasyonu takiben, üretilen lakrimal germ, pilokarpin ile uyarıldıktan sonra laktoferrin gibi gözyaşı proteinleri salgılayabilir. Benzer şekilde, desenli kalıplarda üretilen ve lipoaspirat kaynaklı pluripotent kök hücrelerden ve MKH’lerden oluşan sferoidler, farklılaşma kapasitelerini koruyabilir ve hayvan modelinde kornea stromasını onarabilir.¹³²

Düzenlemeler, Ticarileştirme ve Etik

Biyomühendislik ürünlerinin insanlarda kullanımına ve ticarileştirilmesine ilişkin düzenlemeler, yeni ürünler ortaya çıktıkça gelişmektedir. Bununla birlikte, EKH ve hayvan deneyleri ile yeni terapötik ajanlar geliştirilmeye çalışması hakkındaki etik tartışmalar yıllardır sürmektedir. Hastalık modelleri için çip üstü organ teknolojisinin kullanılması, ilaç üreticilerinin hayvan deneylerine olan ihtiyacını azaltabilir. İnsan embriyolarının kullanımı ile ilgili etik kaygılar ve hastaların kan gruplarına göre eşleştirilmesindeki sorunlar iPSC’ler ile aşılabilir. Bununla birlikte, türetilmiş hücrelerin kaynak hücrenin gen ekspresyonuna devam etmesine neden olacak epigenetik bellek ve iPSC’lerin sonsuz çoğalma kapasitesi ile teratoma dönüşebilme olasılığı ile ilgili güvenlik endişeleri devam etmektedir.⁵⁰