ÖZET

Amaç:

Tavşanlarda tapetoretinal dejenerasyon modelinde kemik iligi mezankimal kök hücre (MKH) intravitreal implantasyonunun uygulanabilirligini araştırmak.

Sonuçlar:

İntravitreal allojenik kök hücre implantasyonu retina dejenerasyonlu gözlerde uygulanabilir bir yöntem olarak gözükmektedir.

Bulgular:

Birinci günde çalışma grubundaki tavşanlarda anormal ERG b degerleri ve çalışma grubundaki 1 tavşanın histopatolojik olarak incelenen her iki gözünde retina iç katları ile RPE'de (Retina Pigment Epiteli) minimal düzensizlik ve ödem saptandı. Beşinci günde ERG'de silinme, OKT'de retinada kalınlaşma ve 1 tavşandaki histopatolojik incelemede retina iç katları ve fotoreseptör tabakada düzensizlik saptandı. Onuncu günde FFA'da (Fundus Floresein Anji-yografi) lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklar, ERG'de silinme ile 1 tavşandaki histopatolojik incelemede solda daha belirgin olmak üzere RPE'den koroide uzanan belirgin pigment dispersiyonu ve fotoreseptör katmanında, düzensizlik saptandı. Yirminci günde oftalmoskopide her iki gözde pigmenter dejenerasyon bulguları ile birlikte sag gözde daha belirgin olarak kon-ERG genliklerinde artış saptandı. ERG'de çalışma grubu sag gözlerinde soldakine kıyasla genlik artşımn 30.günde devam ettigi saptandı. Çalışma gözlerinden birinde olası MKH kökenli prepapiller kitle gözlendi. Kontrol grubunun sag gözlerinde klinik ve histopatolojik enflamas-yon bulgusu saptanmadı.

Yöntem:

GATA Araştırma Merkezi'nde erişkin bir Yeni Zelanda albino tavşanın femur proksimalinden alınan kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koşullarda MKH diferansiye edildi ve 4. pasajdaki hücreler kullanıldı. Altı erişkin pigmentli tavşana intravenöz 40 mg/kg sodyum iyodat enjeksiyonu uygulandı (çalışma grubu). Hemen sonrasında kontrol olarak seçilen 1 erişkin pigmentli tavşan ile çalışma grubundaki 6 tavşanın sag gözlerine 2.5X10 (5) hücre/ 0.1 ml, sol gözlerine 0.1 ml dengeli tuz solusyonu (BSS) intravitreal enjeksiyonu uygulandı. Tavşanlarda 1, 5, 10, 20 ve 30.günlerde oftalmoskopik, anjiyografik, OKT (Optikal Koherens Tomography), ERG (Elektroretinografi) ve histopatolojik inceleme yapıldı.

GİRİŞ

Retinanın herediter ve edinsel kökenli dejeneratif hastalıkları tüm toplumlarda önde gelen körlük nedenidir. Günümüzde bu hastalıkların kökten tedavileri konusunda somut gelişmeler izlenmektedir. Bunlar arasında kök hücre aracılı tedavi arayışları önde gelmektedir. Bu hücrelerin hemen her organda bulundukları ve doku yenilenmesinde görev aldıkları bilinmektedir. Multipotent olan bu hücre grubunun ortamdaki uygun uyaranlar ile pek çok işlevsel hücre tipine farklılaştırılabilecegi gösterilmiştir (1,2). Gözdeki kök hücre miktarının azlıgı ve teminindeki zorluklar bunların tedavi maksatlı uygulamalarını zorlaştırmaktadır. Mezenkimal kök hücrelerin (MKH) kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüşebildikleri gösterilmiştir (1). Ayrıca koroid neovasküler membran (KNM) gelişiminde kemik iligi kökenli kök hücrelerin katkıda bulundugu gösterilmiştir (3). İnsanda bu hücrelerin temini kolaydır ve otojenik ya da allojenik uygulandıkları başarılı klinik uygulamaları da vardır. Bu hücreler, retina dejenerasyon ve distrofilerinin tedavisinde bir umut kaynagı olabilir.

Çalışmamızda, gelecek klinik uygulamalara esas olmak üzere tavşan tapetoretinal dejenerasyon modelinde kemik iligi mezankimal kök hücre (Kİ-MKH) intravitre-al implantasyonunun uygulanabilirligi araştırılmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Çalışmamız Nisan-Mayıs 2006 tarihlerinde Gülha-ne Askeri Tıp Akademisi (GATA) Araştırma Merke-zi'nde gerçekleştirildi. Çalışma için GATA Hayvan Çalışmaları Etik Kurulu'nun onayı almdı.

GATA Araştırma Merkezi'nde erişkin bir Yeni Zelanda albino tavşanın proksimal femurundan alman kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koşullarda kemik iligi mezenkimal kök hücreler (Kİ-MKH) diferansiye edildi ve 4. pasajdaki hücreler kullanıldı. Altı erişkin (33.5 kg) pigmentli tavşana kulaktan intravenöz yolla, dengeli tuz solusyonundaki (FTS) %1'lik sodyum iyodat (NaIO(3), Sigma, St Louis, MO) solusyonundan 40 mg/ kg enjeksiyon uygulandı (çalışma grubu). Hemen sonrasında bu tavşanlar yanısıra 1 erişkin pigmentli tavşanm (kontrol tavşan) sag gözlerine 2.5X10 (5) hücre/0.1 ml, sol gözlerine 0.1 ml FTS uygulandı. Bunun için %0.5 tropicamide (Tropamid®, Bilim, İstanbul, Türkiye) ile pupiller midriyazis ve Betadine %10 solusyon ile kon-jonktival sterilizasyon saglandı. 30 G igne ile limbustan 1.5 mm geriden ve üst temporalden kontrollü olarak int-ravitreal enjeksiyon uygulandı. Bazal degerleri belirlemek üzere tedavi öncesinde ve tedavi sonrası 1., 5., 10., 20. ve 30.günlerde oftalmoskopik, anjiyografik, OKT (Optikal Koherens Tomografi), ERG (Elektroretinogra-fi) ve histopatoloji incelemeleri yapıldı. Bu maksatla klinigimizde mevcut görüntüleme sistemleri (Zeiss HRA™, Zeiss Stratus OCT™, Roland Elektrodiagnos-tik ünit™) kullanıldı. Histopatolojik inceleme için intra-kardiak embolizasyon ile feda edilen tavşan gözlerinde enükleasyonu takiben gözler fiksasyon için tamponlu %4'lük Paraformaldehit solüsyonu içine konuldu. Fik-sasyonda 2 gün bekleyen gözlerin gözdışı bag ve kas dokuları yanı sıra Ora Serrata önündeki dokuları mak-roskopik olarak ayıklandı ve bu dokulardan hazırlanan parafin bloklarından 5 mikronluk kesitler almdı. Hemo-toksilen & Eozin ile boyama sonrası ışık mikroskopu ile retina tabakasının katmanları incelendi. Çalışma grubundaki tavşanlar ile kontrol tavşanm sag ve sol gözlerindeki bulgular grup içi ve gruplar arası degişiklikler bakımından karşılaştırıldı.

BULGULAR

Birinci günde kontrol ve çalışma grubundaki ERG kayıtları Şekil'de (Şekil 1a: kontrol ERG; 1b: çalışma grubu ERG) izlenmektedir. Çalışma grubunda ERG b dalga genliklerinde belirgin azalma izlenmektedir. Histopatolojik incelemede, plasebo uygulanan gözden alınan normal retina kesitine (Şekil 2a) kıyasla çalışma grubundaki bir tavşanm her iki gözündeki kesitlerde benzer tarzda retina iç katları, iç nükleer ile RPE (Retina Pigment Epiteli) katmanında gözlenen düzensizlik ve ödem dikkati çekti (Şekil 2b).

Beşinci günde skotopik, fotopik ve fliker ERG'de b dalgası genlik kayıpları gözlendi (Şekil 3a ve b).

OKT'de başlangıçtakinden farklı olarak her iki gözde RPE incelmesi ve retina kalmlık artımı (Şekil 4a: kontrol tavşandaki ortanca kalmlık: 135 mikron; 4b:çalışma grubu ortanca kalmlık 161 mikron) saptandı.

Onuncu günde çalışma grubundaki bir tavşanda histopatolojik incelemede sag gözde (Kİ-MKH implan-tasyonlu) ve sol gözde (kontrol göz) retina iç katları, iç nükleer ve fotoreseptör tabakada düzensizlik ve ödem ile RPE ve koroidde dezorganizasyon ve pigmentasyon artımı saptandı (Şekil 5a ve 5b).

Yirminci günde, 10. günden itibaren FFA'da (Fun-dus Floresein Anjiyografi) erken ve geç evrede izlenen lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklar belirginleşti (Şekil 6). 20. günden itibaren oftalmoskopide her iki gözde yaygm pigmenter dejenerasyon bulguları ile birlikte FFA'da tipik benekli tapetoretinal dejenerasyon bulgusu yerleşti (Şekil 7a ve b); bu dönemde sag gözde, soldaki genliklere kıyasla fotopik ve skotopik-ERG yanıtlarında artış saptandı (Şekil 8a ve b).

30. günde bir tavşanda optik sinir başmdan vitreusa uzanan iç limitan membranm düzenini bozmayan, igsi ve oval küçük hücrelerden (olası Kİ-MKH) oluşan fib-rovasküler yapı saptandı (Şekil 9). Çalışma ve kontrol grubu tavşan sag gözlerinde klinik inceleme (Şekil 10: kırmızıdan yoksun ışıkta fundus) ve histopatolojik olarak (Şekil 11) vitreusta ve retinada enflamasyon gözlenmedi. ERG'de çalışma grubu sag gözlerinde soldakine kıyasla kayda deger elektriki potansiyel artışı saptandı (Şekil 12a ve b).

TARTIŞMA

Kemik iligi kök hücrelerin retina nöron hücrelerine farklılaştıkları gösterilmiştir (4). Amfibiandakinin aksine insan retina nöral hücreleri apopitoza ugrayıp kaybol-dugunda kayıpların rejenerasyonla karşılanamadıgı bilinmekteydi. Son yıllarda insanda retinal nöral kök hücreleri (RNKH) ve bunlara öncülük eden embriyonik Şekil 5a. kök hücreler (EKH), nöral kök hücreler (NKH) ve retinal kök hücreler (RKH) gösterilmiştir (5,6). Ancak bu kök hücre gruplarının tedavi amaçlı uygulamalarında ciddi sorunlar gözlenmesi olasılıgı vardır. EKH'de MHC (Major Histocompatibility Complex) sisteminin dışlayıcı etkisi yanı sıra teratom geliştirebilme riski vardır; NKH'nin ise Hipokampus'tan temini zordur. Sıklıkla Korpus Siliare'de bulundukları gösterilmiş olan RNKH'nin ise sayıları oldukça sınırlı olup temini zordur. Bu durumda uygulanması kolay ve halen hematoloji klinik uygulamalarında etkinligi kanıtlanmış olan kemik iligi kökenli kök hücreler en uygun tedavi yaklaşımı olarak gözükmektedir.

Kemik iligi kök hücrelerin kemirici ve insanlarda hemopoetik kök hücreler yanı sıra mezenkimal kökenli kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüştügü gösterilmiştir (1). Koroid neovasküler membran (KNM) gelişiminde Kİ-MKH'lerin katkısının gösterilmesi dikkat çekicidir (3). Japon araştırmacılar, retina yaralanmalı sıçanlarda Kİ-MKH'lerin yaralanmalı alana lokalizasyonu ile birlikte retina sinir hücresine dönüşümü göstermişlerdir (7). Aynı araştırmacı grup B6 transjenik fare gözlerine retina fotokoagulasyonu ile birlikte intravitreal kök hücre transplantasyonu uyguladıklarında bunların retinal nöron hücrelerine dönüştükleri ve bu transforme hücrelerin 1 yıl süreyle işlevselliginin devam ettigini göstermişlerdir. Fotokoagulasyon ile uyarım yapılmayan kontrol gözlerde ise nöronal hücrelere dönüşüm daha kısa süreli ve daha az sayıda olmuştur (8).

Kemiricilerde sodyum iyodat ile tapetoretinal dejenerasyon gelişimi, uzun yıllar içinde oldukça iyi tanımlanmış örnek bir modeldir. Enzmann ve arkadaşları B6 transjenik fare sujunda yaptıkları özgün çalışma ile RPE'nin anatomik degişikliklerine eşlik eden işlevsel degişikliklerin uygulanan sodyum iyodat dozu ve uygulama sonrası süre ile dogrusal etkilenim gösterdigini bildirmektedirler (9). Çalışmamız tavşan retinasının geç dönemde kendini yenileme olasılıgma karşı 30 günlük dönem için planlanmış ve sodyum iyodatm bu dönem için etkinligi kanıtlanmış olan 40mg/kg dozu uygulanmıştır. Çalışmamızda ilk olarak 1. günde ERG ile tanımlanan işlevsel degişiklikler gözlenmiştir (Şekil 1). Beşinci günden itibaren OKT retinada kalınlaşmayı göstermiştir (Şekil .4). FFA'da 10. günde papillaya yakın RPE defektleri oluşmuş ve 20. günde tüm retinada yerleşmiştir. Histopatolojik kesitlerde de izlenebildigi gibi retina içi ve koroidde pigmentasyon sonucu geliş tigi anlaşılan hiperpigmente ve hipopigmente alanlar, 20.günde oftal-maskopik olarak pigmenter retinopatidekine benzer tarzda tapetoretinal dejenerasyon olarak gözlendi (Şekil 7). Bu dönemde, başlangıçta silik olan ERG kayıtlarının tedavi uygulanan gözde özellikle fotopik ERG'de daha belirgin olmak üzere, diger gözdeki ERG kayıtlarından gözlenebilir farklar gösterdigi saptandı. Bu farklar 30.günde de devam etti. (Şekil 12). Kontrol tavşanda Kİ-MKH'nin implante edildigi gözde kayda deger bir degişim, enflamasyon gözlenmedi (Şekil 10 ve 11). Benzer şekilde çalışma grubunda Kİ-MKH'lere karşı belirgin bir enflamasyon saptanmadı. Bunda Kİ-MKH'le-rin varoldugu ileri sürülen antienflamatuvar etkilerinin rolü bulunabilir (2). Kök hücre implante edilen tedavi gözlerin kontrollere kıyasında, histopatolojik belirgin bir fark gözlenmemekle birlikte ERG kayıtlarında daha iyi elektriki potansiyele sahip olmaları, bununla birlikte kontrol tavşandaki kök hücre implantasyonunda retinada herhangi bir yapısal yada elektriki potansiyel farkı gözlenmemesi, bu işlemin toksik yada olumsuz bir etkisi bulunmadıgmı dolaylı olarak göstermektedir. Bununla birlikte, çalışma grubundaki bir gözde Kİ-MKH kökenli oldugu düşünülen fibrovasküler proliferatif bir kitle gözlenmesi dikkat çekicidir. İleri çalışmalarda bu hücrelerin immünhistokimyasal yöntemler ile kökeninin belirlenmesi planlanmıştır. Ayrıca, çalışma grubundaki ve kontrol olarak seçilen tavşanın kök hücre implante edilmemiş olan diger gözlerinde beklenenden farklı histolojik ve elektrofizyolojik bulgulara rastlanmamıştır. Bu durum, kök hücre implante edildikten sonraki süreçte diger gözün bundan etkilenmedigini ortaya koymaktadır. Gözlemlerimiz sodyum iyodatm asıl etkisinin RPE'de mela-nosit oksidasyonu ile oluştugu, diger bulguların buna eşlik ettigi görüşünü desteklemektedir (10). Retinanın he-rediter ve edinsel pek çok hastalıgmda RPE yapısal ve işlevsel bozukluklar göstermektedir. Fötal yada embri-yonik hücre transplantasyonu yam sıra matür RPE hücreleri ile RPE yapısal ve işlevsel bozukluklarının giderilmesi çalışmalarında karşılaşılan sorunlar, üzerinde yo-gun çalışmaların yapıldıgı subretinal RPE transplantasyonu benzeri yöntemlerin klinik uygulamaya geçirilmesini güçleştirmektedir. Bu sorunların başında progenitor hücrelerin nitelik ve niceliksel olarak yetersiz kalmaları, retinaya ulaş tınlamamaları yada reorganize olamamaları gelmektedir. Bu zorluklar Kİ-MKH'lerin intravitreal implantasyonu ile aşılabilir gözükmektedir. Ancak, bu yöntemin oftalmolojide uygulanmasında gözün özgün anatomik işlevsel bütünlügü, örnegin kan-retina ve kan-aköz bariyerleri yam sıra gözün immün özgünlügünün dikkate almması gerektigini düşündük. Bu amaçla, başlangıç aşamasında bu yöntemin uygulanabilirliginin ir-delendigi bu çalışmamızın sonuç hedefi, bu yöntemin klinik uygulamaya geçirilmesidir. Y öntemin pratikte uy-gulanabilirligini araştırmak üzere, temini, muayenesi ve izleminin kolaylıgı ile öteden beri preklinik çalışmalarda kullandıgımız ve imsamdakime yakm boyutta gözü olan tavşan, denek olarak seçilmiştir. Ayrıca tapetoretinal dejenerasyon oluşturdugu kaynakçada iyi tanımlanmış olan sodyum iyodat modeli kullanılmıştır. Oksidasyon yoluyla etkili oldugu bilinen sodyum iyodatla tepkimeye girmesi için retinasında melanin içeren pigmente tavşanlar seçilmiş, böylece insandakine benzer bir konum sag-lanmıştır. Kİ-MKH temin etmek üzere GATA Araştırma Merkezi'nde üretimi gerçekleştirilen Yeni Zelanda tipi albino tavşanın proksimal femurundan alman kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koşullarda mezenkimal kök hücreler diferansiye edilmiş ve yenilenme potansiyellerini kaybetmemeleri için 4. pasajdaki hücreler kullanılmıştır. Çalışmanın degerlendirilmesi için alışılagelmiş klinik muayene yöntemleri (Oftalmoskopi, FFA ve ERG yanı sıra OKT) uygulanarak gelecekteki hayvan ve insan uygulamalarında yararlanabilecegimiz gereçlerin uygulanabilirligi araştırılmıştır. Böylece, örnegin, gelecek çalışmalarda OKT kullanılarak daha az sayıda hayvanda histopatolojik tetkik gereksinimi duyulabilecegi, ancak bunun için 5 gün geçmesi gerekti gi anlaşılmıştır. Bununla birlikte, çalışmamızdaki tavşanda OKT sonuçlarının kaynakça için başvuru degeri bulundugu da anlaşılmaktadır.

Kİ-MKH teminindeki sorunlar nedeniyle çalışmamızda denek sayısı smırlı tutulmuş (6 adet), etik nedenler ve kontrol saglanabilmesi bakımından sol gözlere plasebo işlem (FTS) uygulanmıştır. Aynı nedenle otojen yerine allojenik transplantasyon uygulanarak bu yöntemin tedavideki etkinligi araştırılmıştır. Çalışmamız allojenik Kİ-MKH intravitreal uygulandıgında immün redde ugrayamayacaklarmı da göstermektedir. Bu durum Kİ-MKH uygulandıgı diger çalışmalarda da izlenmiş olup, bu durumun hücrelerin immünosüpressif etkisinden kay-naklandıgı ileri sürülmüştür (2).

Sodyum iyodat ile her iki gözünde dejenerasyon oluşturulmasına karşm Kİ-MKH uygulanan gözlerde 20. ve 30. günlerde uygulanmayan gözlerdekinden göreceli olarak daha az işlevsel hasar gözlenmesi ve kontrol gözlere kıyasla retina kalmlıgınm daha az olarak izlenmesinde Kİ-MKH direk ve dolaylı tesirleri bulunabilir. Bunda dejenerasyona yerleşmeden önceki evrelerde oluşan enflamasyon ile Kİ-MKH'den ortama salınan trofik faktörler, örnegin bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) rolü bulunabilir. İleri çalışmalarla bu faktörler tanımlanabilir ve immünhistokimyasal boyama yöntemleri kullanılarak rejenere olan hücrelerin kök hücre ile ilişkileri ortaya konabilir.

Obata ve arkadaşları tavşan sodyum iyodat modelinde, fibroblast ve vasküler endotel hücrelerinden farklı olarak RPE üzerinde uyarıcı etkisi olan doku faktör plazminojen yol inhibitörünün (TFPI) intravitreal uygu-landıgı tarafta RPE katmanının korundugunu, bu korumanın herediter retina dejenerasyonlu RCS sıçanlarda kısmen gerçekleştigini göstermişlerdir (11). Hayvan modellerinde büyüme faktörlerinin retinayı lezyon gelişiminden korudukları gösterilmiştir (12). Bununla birlikte bu faktörlerin uygulanmasında karşılaşılan en önemli sorun ortamdaki homeostasisin bozularak istenmeyen hücre grupları, örnegin, fibrobalastlar üzerinde trofik etki gösterebilme olasılıklarıdır. Üstelik bu yöntemler ile ancak mevcut potansiyel korunabilir. Oysa, kök hücre aracılı yöntemler ile istenilen hücre tipinin, eksikligi duyulan alanda yeniden kazanılması mümkündür. Ancak, bunun için uygun bir uyaran ortama gereksinim duyulmaktadır (13).

Kaynakçada özgün bir yere sahip oldugunu saptadı-gımız bu çalışmamızdaki gözlemlerimiz, intravitreal Kİ-MKH implantasyonunun tapetoretinal dejenerasyon ile seyreden hastalıklarda etkin bir yöntem olarak uygulanabil ecegini düşündürmektedir. Bununla birlikte, çalışmamızda ileri emniyet ve etkinlik çalışmalarına gereksinim duyulmuştur. Uygulama sonuçlarının izlenmesinde OKT ve ERG'nin önemli bir yeri olabilecegi anlaşılmaktadır. Çalışmamızda bu etkinligin allojenik transplantasyonlarda gözlenmesi anlamlıdır. Bu çalışma allojenik transplantasyon modeli üzerine kurulmuş ve farklı özellikleri olan aynı türden diger bir canlı çalışma kapsamına alınmıştır. Bu amaçla pigmentli tavşanda oluşturulan tapetoretinal dejenerasyon modeli üzerinde albino tavşan kemik iliginden alman ve diferansiye edilen kök hücrelerin intravitreal implantasyonu tedavisi araştırılmıştır. Bununla ilgili ileri çalışmalarımız halen devam etmekte olup dejenere RPE modelinde kök hücrenin pigment epi teline dönüşümü saglandıgında oluşan RPE tabakasının melanosit içeriginin bu tedavinin etkinligi için histolojik bir parametre olarak degerlendirilmesi planlanmıştır.

İnsanda, intravitreal uygulamadaki tecrübelerimiz, hayvandakinden daha kolay otolog Kİ-MKH temin edebilme olasılıgımız ve bu tedaviden beklentilerimizin bü-yüklügü, bu yöntemin klinige uyarlanabilmesi dogrultu-sunda ileri preklinik doz ve emniyet çalışmalarının yapılmasını zorunlu kılmaktadır. Bu yöntemin herediter tapetoretinal dejenerasyonlar üzerindeki etkinlik ve emniyetini belirlemek üzere ileri preklinik çalışmalar yapılması planlanmıştır.