ÖZET

Amaç:

Tavşanlarda tapetoretinal dejenerasyon modelinde kemik iliği mezenkimal kök hücre (MKH) intravitreal uygulamasının etkinliğini göstermiştik (TOD UOK, 2006). Bu çalışmamızda MKH aracılı gen tedavisinin uygulanabilirliği araştırılmıştır.

Yöntem-Gereçler:

GATA Araştırma Merkezi'nde erişkin Yeni Zelanda albino tavşanın femur proksimali kemik iliğinden alınan MKH'ler vücut dışında farklılaştırıldı ve 4. Pasajdaki hücreler kullanıldı. Kültür ortamında bu hücrelere plazmid aracılı olarak 48 saat içinde 2 defa Yeşil Flöresan Protein (YFP) aktarımı sağlandı. Erişkin, pigmentli 3 tavşana intravenöz 40 mg/kg sodyum iyodat-NaIO(3)- enjeksiyonu uygulandı (çalışma grubu). Hemen sonrasında bu tavşanlar yanısıra bir erişkin pigmentli tavşanın (kontrol) sağ gözlerine 2.5X10(5) hücre/0.1ml, sol gözlerine dengeli tuz solusyonu 0.1ml intravitreal uygulandı. 1, 5, 10 ve 45. günlerde enükleasyon uygulanan tavşanlarda, izlem sürecinde, klinik, Fundus Floresein Anjiyografi (FFA, HRA- 2®), Elektroretinografi (ERG, Roland®) ve histopatoloji (immünşöresan) incelemeleri yapıldı.

Sonuçlar:

Akut tapetoretinal dejenerasyon modelinde, plazmid aracılığıyla transfekte edilen ve intravitreal uygulanan allojenik kök hücrelerden retinaya YFP aktarımı sağlanabilmektedir. Bu yöntem, otolog MKH'lerin kullanılma avantajı bulunan retinal dejenerasyon olguları için yeni bir gen tedavisi yaklaşımı olarak geliştirilebilir.

Bulgular:

Birinci günde çalışma grubundaki tavşanlarda anormal ERG b dalga değerleri ve HRA (Heidelberg Retinal Anjiografi)'da vitreusta YFP'li hücre kümeleri gözlendi. Beşinci günde retinada ödem, ERG'de b dalgasında silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoşöresan odaklar saptandı. Birinci tavşanda uygulanan enükleasyon sonrası immünşöresan yöntemi ile retinada YFP taşıyan hücreler gösterildi. Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklarda artış, ERG'de silinme izlenen bir tavşanda canlı ve cansız ortamda uygulanan yöntemler (HRA ve immünflöresan) ile vitreusta ve retinada YFP'li hücrelerin varlığı gösterildi. Kırkbeşinci gündeki kontrollü gözlemlerde bu hücrelerin retina katmanlarındaki varlığının devam ettiği saptandı.

GİRİŞ

Retinanın kalıtsal ve edinsel kökenli dejeneratif hastalıkları tüm toplumlarda önde gelen körlük nedenidir. Günümüzde bu hastalıkların kökten tedavileri konusunda somut gelişmeler izlenmektedir. Bunlar arasında kök hücre aracılı tedavi arayışları önde gelmektedir. Bu hücrelerin özgün hücre tiplerine dönüşme potansiyeli hücre replasmanı tedavisinde yeni bir çığır açmakla birlikte uygun koşullar altında genetik olarak modifiye edilebilmeleri yeni bir dönemin işaretçisi olabilir (1-3). Bu hücrelerin hemen her organda bulundukları ve doku yenilenmesinde görev aldıkları bilinmektedir. Multipotent olan bu hücre grubunun ortamdaki uygun uyaranlar ile pek çok işlevsel hücre tipine farklılaştırılabileceği gösterilmiştir (4,5). Varlığı son yıllardaki çalışmalarla kanıtlanmış olan göz içi dokuları ile retinadaki kök hücrelerin miktarının azlığı ve teminindeki zorluklar, bunların tedavi maksatlı uygulamalarını zorlaştırmaktadır. Halen klinik uygulanmada temini kolay ve etkinliği kanıtlanmış olan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerin (Kİ-MKH) kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüştüğü ve koroid neovasküler membran (KNM) gelişiminde de rol aldığı gösterilmiştir (4,6). İnsanda bu hücrelerin temini kolaydır ve otojenik ya da allojenik başarılı klinik uygulamalarıda vardır. Genetik olarak modifiye edilebilen bu hücreler, retina dejenerasyon ve distrofilerinin tedavisinde bir umut kaynağı olabilir.

Tavşanlardaki tapetoretinal dejenerasyon modelinde Kİ-MKH'lerin intravitreal implantasyonundaki tedavi etkinliğini göstermiştik (7). Aynı modelde gerçekleştirdiğimiz bu çalışmamızda, dış ortamda YFP (Yeşil Flöresan Protein) üretmek üzere plazmid aracılı olarak modifiye edilen bu hücrelerin intravitreal implantasyonundaki tedavi etkinliği araştırılmaktadır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Çalışmamız Nisan-Mayıs 2007 tarihlerinde Gülhane Askeri Tıp Akademisi (GATA) Araştırma Merkezinde gerçekleştirildi. Çalışma için GATA Hayvan Çalışmaları Etik Kurulu'nun onayı alındı. Uygulamalar:

1. Kİ-MKH'lerin elde edilmesi:

GATA Araştırma Merkezi'nde erişkin bir Yeni Zelanda albino tavşanın femur proksimalinden alınan kemik iliği stromal hücrelerden in-vitro koşullarda Kİ-MKH diferansiye edildi ve 4. pasajdaki hücreler kullanıldı. Bu amaçla hücresel içerik 1:1 oranında düşük glukozlu DMEM (Dulbecco'nun hücre kültür ortamı) ortamında seyreltildi. Elde edilen süspansiyon 15ml Ficoll-Pague Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, İsvec) üstünde toplandı ve oda ısısında 800 devirde santrifüj işlemi uygulandı. Üstteki kısım ara yüzey ile birlikte 0.1 ml PBS (fosfat tamponlu tuzlu su solusyonu) ile seyreltilip 800 devirde 10 dakika santrifüj işlemi uygulandı.

Üst kısmı atılıp 1ml'lik kısımda pellet karıştırıldı. Nukleuslu hücreler sayıldı ve kültür ortamında (2mg/ml Lglutamin 50mg/ml streptomisin ve %10 oranında ısı inaktivasyonlu buzağı serumu içeren DMEM solusyonu) 1x10(7)/ml olacak şekilde süspanse edildi ve 100ml'lik kültür tabaklarında 3x10(6) hücre/cm(2) olacak şekilde ekildi. Bu hücreler 3 gün kültür ortamında tutuldu ve yapışmayan hücreler 3 kez yıkanarak ortamdan uzaklaştı rıldı. Kültür ortamında yeterince yoğunlasan (konfluent) hücrelere tripsin-EDTA uygulanarak üreme ortamından ayrılmaları sağlandı.

2. Kİ-MKH'lerde YFP Plazmid vektör transfeksiyonu:

Transfeksiyon uygulamaları için Kİ-MKH kültürlerinde 4. pasajdaki hücreler kullanıldı. Gen ekspresyonu için YFP olarak, Monster Green™ Flöresan protein phMGFP (Promega, USA) kullanıldı. Kültür ortamında bu hücrelere plazmid aracılı olarak 48 saat içinde iki defa Yeşil Flöresan Protein (YFP: GFP) aktarımı sağlandı. Daha önceden tanımlanmış protokole (8) uygun olarak yapılan ön çalışmalarla Kİ-MKH'lerinde yüksek transfeksiyon etkinliği sağlayan parametreler belirlendi. Kısaca, bir gün önceden kültür ortamından alınarak serum ve antibiyotik içeren taşıma ortamlarına geçirilen hücreler 10ml'lik tüplerde yıkama ve santrifüjleme işlemleri ile kültür ortamından uzaklaştırıldı. Hücrelerin ekimi, seyreltilmesi, inkübasyonu ile hazırlanan DNA-Enhansır solusyonunun pipetle karıştırılması, çalkalanması sonrası elde edilen efektif reagant içeren karışım, 60ml kültür ortamı için 1μg (mikrogram) plazmid DNA'sına 8 μg Enhansır ve 25 μg Effektan Reagan olacak şekilde uygulandı.

3. Tapetoretinal dejenerasyon modelinde uygulamalar: Üç erişkin (3-3.5 kg) pigmentli tavşana kulaktan intravenöz yolla, dengeli tuz solusyonundaki (FTS) %1'lik sodyum iyodat (NaIO(3), Sigma, St Louis, MO) solusyonundan 40 mg/kg dozunda enjeksiyon uygulandı (çalışma grubu). Hemen sonrasında bu tavşanlar yanı sıra bir erişkin pigmentli tavşanın (kontrol tavşan) sağ gözlerine 2.5X10 (5) hücre/0.1ml, sol gözlerine 0.1ml FTS uygulandı. Bunun için %0.5 tropicamide (Tropamid®, Bilim, Istanbul, Türkiye) ile pupiller midriyazis ve Betadine %10 solusyon ile konjunktival sterilizasyon sağlandı. 30 G iğne ile limbustan 1.5 mm geriden ve üst temporalden kontrollü olarak intravitreal enjeksiyon uygulandı. Bazal değerleri belirlemek üzere tedavi öncesinde ve tedavi sonrası 1., 5., 10., ve 45. Günlerde oftalmoskopik, anjiyografik, elektrofizyolojik ve immünflöresan incelemeler yapıldı. Bu amaçla kliniğimizde mevcut görüntüleme sistemleri (Zeiss HRA™,Roland Elektrodiagnostik ünit™) kullanıldı. Histopatolojik inceleme için intrakardiak embolizasyon ile feda edilen tavşan gözlerinde enükleasyonu takiben gözlerin gözdışı bağ ve kas dokuları yanı sıra Ora Serrata önündeki dokuları makroskopik olarak ayıklandı ve bu dokulardan hazırlanan parafin bloklarından 5 mikronluk transvers kesitler alındı. Bu örnekler İmmunflöresan mikroskop ve Hemotoksilen-Eozin ile boyama sonrasıışık mikroskopu ile retina katmanları incelendi.

Çalışma grubundaki tavşanlar ve kontrol tavşanın sağ ve sol gözlerindeki bulgular grup içi ve gruplar arası değişiklikler bakımından karşılaştırıldı.

BULGULAR

Kültür ortamında YFP-plazmid ile transfekte Kİ-MKH gözlenmektedir (Şekil 1).

Birinci günde kontrol ve çalışma grubundaki ERG (Elektroretinografi) kayıtları Şekil 2'de izlenmektedir. HRA ile otoflöresan modda gözlem yapıldığında kontrol ve çalışma grubundaki tüm tavşanlarda intravitreal YFP'li hücreler saptandı (Şekil 3a, 3b).

Beşinci günde retinada ödem, ERG'de b dalgasında silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoflöresan odaklar belirginleşme gözlendi. HRA'da vitreusta ve retinada fotoreseptör ve RPE katmanında YFP eksprese eden hücreler saptandı (Şekil 4a, 4b).

Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklarda artış (Şekil 5a) ile ERG de silinme izlenen bir tavşanda canlı ve cansız ortamda uygulanan yöntemlerle (HRA ve immünflöresans) vitreusta ve retinada yaygın YFP'li hücre kümelerinin varlığı gösterildi (Şekil 5b).

Kırkbeşinci gündeki gözlemlerde retinanın minimal pigmentasyon değişiklikleri ile birlikte normaldekine benzer görünüme kavuştuğu ve bu hücrelerin retina katmanlarındaki varlığının devam ettiği saptandı (Şekil6a,6b).

Kontrol tavşan gözünde 15.gün muayenesinde izlenebilen YPF'li hücrelerin 45.günde kaybolduğu saptandı.

TARTIŞMA

Kemik iliği kök hücrelerin retina nöron hücrelerine transdiferansiasyonu ile vasküler ve nörotropik etkinlikleri gösterilmiştir (9). Amfibiandakinin aksine insan retina nöral hücreleri apoptosise uğrayıp kaybolduğunda kayıpların rejenerasyonla karşılanamadığı bilinmekte idi. Son yıllarda insanda retinal nöral kök hücreleri (RNKH) ve bunlara öncülük eden embriyonik kök hücreler (EKH), nöral kök hücreler (NKH) ve retinal kök hücreler (RKH) gösterilmiştir (10,11). Ancak bu kök hücre gruplarının tedavi maksatlı uygulamalarında ciddi sorunlar gözlenmesi olasılığı vardır. EKH'de MHC (Major Histocompatibility Complex) sisteminin dışlayıcı etkisi yanı sıra teratom geliştirebilme riski vardır (12); NKH'nin ise Hipokampus'tan temini zordur. Sıklıkla Korpus Siliare'de bulundukları gösterilmiş olan RNKH (retinal nöral kök hücre)'nin sayıları oldukça sınırlı olup temini zordur. Günümüzde, uygulanması kolay ve hematoloji pratiğinde etkinliği kanıtlanmış olan kemik iliği kökenli kök hücrelerinden evrensel boyuttaki beklentiler, Kociok'un "Hastanın kendi kök hücresi retinitis pigmentoza ve diğer göz hastalıklarında koni görüşünü koruyabilir mi?" başlıklı makalesinde ifadesini bulmuştur (13). Kİ-MKH gibi erişkin kök hücre grubunda etkin transfeksiyon yöntemlerinin geliştirilmiş olması bu sorunun yanıtının olumlu olacağına inancımızı arttırmaktadır (2).

Kemik iliği kök hücrelerin kemirici ve insanlarda hemopoetik kök hücreler yanı sıra mezenkimal kökenli kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüştüğü gösterilmiştir (4). Koroid neovasküler membran (KNM) gelişiminde Kİ-MKH katkısının gösterilmesi dikkat çekicidir (11). Japon araştırmacılar, retina yaralanmalı sıçanlarda Kİ-MKH'lerin yaralanmalı alana lokalizasyonu ile birlikte retina sinir hücresine dönüştüğünü göstermişlerdir (14).

Aynı araştırmacı grup B6 transjenik fare gözlerine retina fotokoagulasyonu ile birlikte intravitreal kök hücre transplantasyonu uyguladıklarında bunların retinal nöron hücrelerine dönüştüklerini ve bu transforme hücrelerin 1 yıl süreyle işlevselliğinin devam ettiğini saptamışlardır. Fotokoagulasyon ile uyarım yapılmayan kontrol gözlerde ise nöronal hücrelere dönüşüm daha kısa süreli ve daha az sayıda olmuştur (15).

Kemiricilerde sodyum iyodat ile tapetoretinal dejenerasyon gelişimi, uzun yıllar içinde oldukça iyi tanımlanmı ş örnek bir modeldir. Enzmann ve arkadaşları B6 transjenik fare sujunda yaptıkları özgün çalışmada RPE (Retina Pigment Epiteli)'nin anatomik değişikliklerine eşlik eden işlevsel değişikliklerin uygulanan sodyum iyodat dozu ve uygulama sonrası süre ile doğrusal etkilenim gösterdiğini bildirmektedirler (16). Çalışmamız tavşan retinasının geç dönemde kendini yenileme olasılığına karşı 45 günlük dönem için planlanmış ve sodyum iyodatın etkinliği kanıtlanmış olan 40mg/kg dozu uygulanmıştır. Bu modeldeki tomografik, fundoskopik, anjiyografik, elektrodiyagnostik ve histopatolojik değişiklikler geçen yılki Türk Oftalmoloji Derneği Ulusal Kongresinde sunulmuştur (7). Kısaca, bu çalışmamızda önceki çalışmamızdakine benzer şekilde 1. günde ERG ile tanımlanan işlevsel değişiklikler gözlenmiştir (Şekil 1). Beşinci günden itibaren OKT (Optikal Koherens Tomografi) retinada kalınlaşmayı göstermiş ve FFA'da 1. haftada RPE defektleri oluşmuş, 2. haftadan itibaren tüm retinada yerleşmiştir. Geçen yılki gözlemimizdekine benzer tarzda Kİ-MKH uygulanan gözlerde kayda değer enflamasyon gözlenmemiştir. Bunda Kİ-MKH'lerin varolduğu ileri sürülen antienflamatuvar etkilerinin rolü bulunabilir (5). Kİ-MKH'lerin intravitreal implante edildiği gözlerde fonksiyonel kazanç elde edilmesinde bu hücrelerin retinaya migrasyonu ve transdiferasyonunun rolü bulunabileceği bildirilmişti (17). Retinanın kalıtsal ve edinsel pek çok hastalığında RPE yapısal ve işlevsel bozukluklar göstermektedir. Fötal yada embriyonik hücre transplantasyonu yanı sıra erişkin RPE hücreleri ile RPE yapısal ve işlevsel bozukluklarının giderilmesi çalışmalarında karşılaşılan sorunlar, üzerinde yoğun çalışmaların yapıldığı subretinal RPE transplantasyonu benzeri yöntemlerin klinik uygulamaya geçirilmesini güçleştirmektedir. Bu sorunların başında progenitor hücrelerin nitelik ve niceliksel olarak yetersiz kalması, retinaya ulaştırılamaması yada reorganizasyon olamaması gelmektedir. Bu zorluklar, Kİ-MKH'lerin intravitreal implantasyonu ile aşılabilir gözükmektedir. Ancak, bu yöntemin oftalmolojide uygulanmasında gözün özgün anatomik işlevsel bütünlüğü, örneğin kan-retina ve kanaköz bariyerleri yanı sıra gözün immün özgünlüğünün dikkate alınması gerektiğini düşündük. Bu maksatla, başlangıç aşamasında bu yöntemin uygulanabilirliğinin irdelendiği bu çalışmamızın sonuç hedefi, bu yöntemin klinik uygulamaya geçirilmesidir. Yöntemin pratikte uygulanabilirliğini araştırmak üzere, temini, muayenesi ve izleminin kolaylığı ile öteden beri preklinik çalışmalarda kullandığımız ve insandakine yakın boyutta gözü olan tavşan, denek olarak seçilmiştir. Bu amaçla, tapetoretinal dejenerasyon oluşturduğu kaynakçada iyi tanımlanmış olan sodyum iyodat modeli kullanılmıştır. Oksidasyon yoluyla etkili olduğu bilinen sodyum iyodatla tepkimeye girmesi için retinasında melanin içeren pigmente tavşanlar seçilmifl, böylece insandakine benzer bir konum sağlanmıştır. Kİ-MKH temin etmek üzere GATA Araştırma Laboratuarı'nda üretimi gerçekleştirilen Yeni Zelanda tipi albino tavşanın proksimal femurundan alınan kemik iliği stromal hücrelerden in-vitro koşullarda mezenkimal kök hücreler diferansiye edilmiş ve yenilenme potansiyellerini kaybetmemeleri için 4. pasajdaki hücreler kullanılmıştır. Bu hücreler in vitro koşullarda YFP protein sentezleyen plazmidler aracılığı ile transfekte edilmiştir.

YFP proteini retinaya gen transferinin araştırıldığı kontrollü gözlemlerde tanımlayıcı olarak kullanılmaktadır. Bu geni içeren hücreler mavi ışık altında yeşil flöresans ile mikroskop altında izlenebilmektedir. Gen transferinin yapıldığı hücreler canlı ortamda izlenerek, gen aktarımının etkinliği mevcut organizmaya zarar vermeden kanıtlanabilmektedir. Çalışmamızda, tapetoretinal dejenerasyona uğrayan katmanda YFP eksprese eden bu hücrelerin varlığının kanıtlanması Kİ-MKH'lerin bu maksatla uygulanabileceğini göstermektedir. Kontrol tavşandakinin aksine vitreustaki MKH'lerin akut dejenerasyona uğrayan gözde retinaya göç etmeleri ve bu hücrelerin retinanın rejenerasyonu aşamasındaki fonksiyonel katkısı düşündürücüdür.

Liposomal transfeksiyon yöntemi, dış ortamda transfeksiyonun gerçekleştirilmesinde günümüzde etkin bir yöntem olarak oldukça sık olarak uygulanmaktadır. Nükleotransfeksiyon olarak da adlandırılan bu yöntemin diğerleri ile kıyaslandığında en etkin gen transfer yöntemi olduğu bildirilmiştir (3). Bununla birlikte, bu yöntemin hücreye özgün olarak farklılıklar gösterebildiği ve gen transferi aşamasında toksik olmayan en etkin karışımın elde edilmesi gerektiği bilinmektedir. Bunun için çalışmamızda, ön çalışmalarla transfeksiyon etkinliği daha önceden kanıtlanmış olan protokole uygun YFP transfeksiyon yöntemi uygulanmıştır.

Kİ-MKH teminindeki sorunlar nedeniyle çalışmamı zda denek sayısı sınırlı tutulmuş (3 adet), etik nedenler ve kontrol sağlanabilmesi bakımından sol gözlere plasebo işlem (FTS) uygulanmıştır. Aynı nedenle otojen yerine allojenik transplantasyon uygulanarak bu yöntemin tedavideki etkinliği araştırılmıştır. Çalışmamız allojenik Kİ-MKH intravitreal uygulandığında immün redde uğrayamayacaklarını göstermektedir. Bu durum Kİ-MKH uygulandığı diğer çalışmalarda da izlenmiş olup bunun bu hücrelerin immünosüpressif etkisinden kaynaklandığı ileri sürülmüştür (5).

Kontrol tavşan gözünde daha önceki çalışmamızdakine benzer kayda değer bir yapısal değişlik gözlenmedi. Bununla birlikte vitreustaki YFP hücre yoğunluğunu giderek azalmakla birlikte 45 günlük takipte retinada yerleşmedikleri gözlendi. Nd:YAG hasarı oluşturulan sıçan gözlerindeki 50 günlük takiplerde, normaldekine kıyasla intravitreal Kİ-MKH uygulanan tarafta retinaya kök hücre geçişi ve antiapopitotik gen aktarımı gözlenmiştir (9). Li ve arkadaşları, RPE'den salınan kemoatraktanların (SDF: stromal kökenli büyüme faktörü ve C3: kompleman 3) Kİ-MKH'lerin migrasyonu ve transdiferasyonunu sağladığını göstermişlerdir (18). Obata ve arkadaşları tavşan sodyum iyodat mododelinde, fibroblast ve vasküler endotel hücrelerindan farklı olarak RPE üzerinde stimülan etkisi olan doku faktör plazminojen yol inhibitörü (TFPI) nün intravitreal uygulandığı tarafta RPE katmanının korunduğunu, bu korumanın kalıtsal retina dejenerasyonlu RCS sıçanlarda kısmen gerçekleştiğini göstermişlerdir (19). Hayvan modellerinde büyüme faktörlerinin retinayı dejenerasyon gelişiminden korudukları gösterilmiştir (20). Bununla birlikte bu faktörlerin uygulanmasında karşılaşılan en önemli sorun ortamdaki homeostazisin bozularak istenmeyen hücre grupları, örneğin, fibroblastlar üzerinde trofik etki gösterebilme olasılıklarıdır. Kİ-MKH'lerin edinsel faktörler yanı sıra kalıtsal faktörler ile ortama çağrıldığını, migrasyona ve transdiferansiasyona zorlandığını gösteren çalışmalar vardır (21). Daha ileri çalışmalarla bu faktörler daha iyi tanımlanabilir ve immünhistokimyasal boyama yöntemleri kullanılarak rejenere olan hücrelerin kök hücre ile ilişkileri tam olarak ortaya konabilir.

Gözün immün özgünlüğünün, dış ortamlardan soyutlanmış anatomik ve işlevsel düzeneğinin kök hücre ve gen tedavileri için uygun bir ortam oluşturduğu bilinmektedir (22). Kök hücre aracılı yöntemlerle istenilen hücre tipinin, eksikliği duyulan alanda yeniden kazanılması mümkündür. Ancak, bunun için uygun bir uyaran ortama gereksinim duyulmaktadır (23). Retina distrofi ve dejenerasyonları böyle bir ortamı sağlayabilir. Giderek saflaştırılan ve kolaylaştırılan kök hücre üretme teknikleri gündemdedir. Bu maksatla CNTF (Siliyer nörotrofik faktör), bFGF (bazik fibroblast grovt fakrör), EGF (epidermel grovt faktör) ve aközhümör ile RPE'nin kullanıldığı bilinmektedir (24,25) Memelilerde iris dokusunda retinal doğurgan kök hücre varlığı ve bunların fotoreseptörlere dönüşümü gösterilmiştir (26).

Günümüzde gen transfer yöntemlerindeki hızlı gelişmeler dikkat çekicidir (27). Moleküler tanımlayıcı yöntemlerdeki gelişmeler, insanda retinaya özgün genlerin tanımlanmasını kolaylaştırmıştır. İlerde amfibianlardaki ömür boyu retinal nöronların oluşumunu sağlayan moleküler mekanizmaların (regülatör genlerin) aydınlatılması ile insanda sürekli retina rejenerasyonu için bu moleküllerin gen transferi ile kalıcı tedaviler sağlanabilir.

KNM (Koroid Neovasküler Membran)'ların oluşumunda etkin rol aldığı gösterilen MKH'lerin endotel hücre matürasyonu ile bu hücrelerin hipoksik hasara karşı stabilizasyonunu sağladıkları, besledikleri retinal nöronları apoptosisden korudukları bilinmektedir. Böyle bir yaklaşımın retinanın iskemik hasarına bağlı neovaskülarizasyon gelişimi için koruyucu tedavi yaklaşımı sağlayabileceği öne sürülmektedir (28). Örneğin, yaşa bağlı maküla dejenerasyonundaki KNM için antianjiyogenetik gen transferi ile birlikte uygulanabildiğinde böyle bir yaklaşım kökten tedavi olanağı sunabilir. Kİ-MKH'leri sıçan prematür retinopati modelinde uygulayan Ritter ve arkadaşları, bu hücrelerin iskemik alanlara göçüyle birlikte neovaskülarizasyon gelişimini önlediklerini bildirmektedirler (29). Halen bu amaçla destrüktif uygulamalara başvurulduğu göz önüne alınırsa benzer bir tedavi yaklaşımının klinik uygulamaya geçirilmesinin avantajları daha iyi anlaşılabilir.

Tüm bu ümit verici gelişmelerle birlikte göz önüne alınması zorunlu koşullar da vardır. Allojenik MKH uygulamalarında immün red gözlenebildiği de bildirilmiştir (30) Henüz, KH tanımlayıcı moleküller tam olarak ortaya konamamıştır; transplantasyon yada gen transferi için en uygun hücre tipi bilinmemektedir. En uygun uygulama şekli (intravitreal, subretinal) bilinmemektedir. Dönör yaşının rolü (31), uygulama için en uygun zamanlama, hastalıklı ortamdaki yeni homeostazis ile bu uygulamaların uzun dönem etkinlik, emniyetleri ve olası tümörojenik potansiyelleri göz önünde bulundurulmalıdır.

Karşılaştırmalı bir çalışmada fotoreseptörlere taransdiferansiyasyon sağlanabilmesi bakımından retinal KH'lerin daha avantajlı olduğu bildirilmektedir (32) Arnhold ve arkadaşlarının yakın zamandaki çalışmalarında, doğuştan rodopsin yokluğu ile karakterize RCS (Royal Collage of Surgeon) kör sıçan modelinde, Kİ-MKH'lerin transplantasyonunda, bu hücrelerin RPE ve nöroretinal katmanlara entegrasyonu, nöral ve glial hücrelere transdiferansiasyonu ile işlevsel başarı bildirmektedirler (33). Yakın zamanda yayınlanan çalışmasında Inoue ve arkadaşları Kİ-MKH'lerin subretinal transplantasyonunda başarılı sonuçlar alındığını bildirmektedirler (34).

Kİ-MKH'lerin tedavi maksatlı ilk in vivo uygulamaları Kicic ve arkadaşları ile Tomita ve arkadaşlarına aittir (32,35). Onlar, mekanik debritmanlı sıçan gözlerinde. bu hücrelerin retinanın özellikle dış nükleer katmanı nda yoğunlaştığını ve bunların retinal nöral hücrelere dönüştüğünü göstermişlerdir (32). Çalışmamızdaki gözlemimiz benzerlik göstermektedir. Çalışmamızda, daha homojen retina hasar oluşturmak ve kalıtsal modellerdekine benzerlik göstermesi bakımından sodyum iyodat ile tapetoretinal dejenerasyon modeli kullanılmıştır.

Bu çalışmamızdaki gözlemlerimiz, intravitreal Kİ-MKH implantasyonunun tapetoretinal dejenerasyon ile seyreden hastalıklarda etkin bir yöntem olarak uygulanabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, ileri emniyet ve etkinlik çalışmalarına gereksinim duyulduğu da göz ardı edilemez.. Çalışmamızda bu etkinliğin allojenik transplantasyonlarda gözlenmesi anlamlıdır. Allojenik transplantasyon modeli üzerine kurulmuş bu çalışmada, albino tavşan kemik iliğinden alınan ve plazmid aracılı YFP transdüksiyonu sağlanan kök hücreler, pigmentli tavşanda oluşturulan tapetoretinal dejenerasyonlu gözlerde intravitreal uygulandığında, retinadaki tedavi edici etkinliğin kök hücre aracılı olduğu, bu hücrelerden olan tanıtıcı gen ekspresyonu ile kanıtlanmıştır. Bununla ilgili ileri çalışmalarımız halen devam etmekte olup dejenere RPE modelinde kök hücrenin pigment epiteline dönüşümü sağlandığında oluşan RPE tabakasının melanosit içeriğinin bu tedavinin etkinliği için histolojik bir parametre olarak da değerlendirilmesi planlanmıştır.

İnsanda, intravitreal uygulamadaki tecrübelerimiz, hayvandakinden daha kolay otolog Kİ-MKH temin edebilme olasılığımız ve bu tedaviden beklentilerimizin büyüklüğü, in-vivo etkin ve emniyetli olduğunu gösterdiğimiz bu yöntemin kliniğe uyarlanabilmesi doğrultusunda ileri preklinik doz ve emniyet çalışmalarının yapılması nı zorunlu kılmaktadır. Bu yöntemin kalıtsal tipteki tapetoretinal dejenerasyonlar üzerindeki etkinlik ve emniyetini belirlemek üzere ileri preklinik çalışmalar yapılması planlanmıştır.