ÖZET

Tartışma:

Oluşturduğumuz deneysel modelde uyguladığımız dozlarda bevacizumab pegaptanib’e göre kornea neovaskülarizasyonlarini azaltmada daha etkili bulunmuştur.

Sonuçlar:

Yanık ve neovaskülarizasyon skorları açısından üç grup arasında fark yoktu (sırasıyla p= 0.173 ve p= 0.082). Kornea neovaskülarizasyonu kapladığı yüzey alanı kontrol grubunda %73.83 ± 6.67, bevacizumab grubunda %59.84 ± 6.85, pegaptanib grubunda %82.96 ± 5.59 olarak tespit edildi (p= 0.001). Histolojik değerlendirmede kornea vaskülarizasyonu derecesi kontrol grubunda 13.05 ± 3.21, bevacizumab grubunda 8.86 ± 2.89, pegaptanib grubunda 12.67± 2.04 olarak tespit edildi (p= 0.052).

Yöntem:

21 kobayın sağ kornealari kimyasal olarak koterize edildi. Olgular 3 gruba ayrıldı. Birinci gruba (Kontrol grubu) subkonjonktival dengeli tuz solüsyonu, ikinci gruba subkonjonktival 1 mg bevacizumab, üçüncü gruba subkonjonktival 0.15 mg pegaptanib sodyum enjeksiyonu koterizasyonla aynı zamanda yapıldı. 10. günde kornealarda oluşan yanık ve neovaskülarizasyon seviyesi değerlendirildikten sonra hayvanlar öldürüldü ve gözler histolojik incelemeye alındı.

Amaç:

Kobaylarda oluşturulan deneysel kornea neovaskülarizasyonu modelinde subkonjonktival bevacizumab ve pegaptanib sodyum enjeksiyonlarinin etkinliğinin incelenmesidir.

GİRİŞ

Sağlıklı insan korneasinda herhangi bir damar yapısı bulunmamaktadır. Ancak çeşitli patolojiler sonunda korneada derin ya da yüzeysel vaskülarizasyonlar olusabilmektedir. Bu damarlar görme seviyesini olumsuz yönde etkilemekte, enflamasyon oluşturmakta ve kornea nakli gibi ameliyatların prognozu üzerinde olumsuz etki yapmaktadır (1-5). Insanlarda korneadaki neovaskülarizasyonlari (KN) azaltmak amacıyla diyatermi ve argon lazer fotokoagülasyon kullanılsa da bu tekniklerin klinik etkinlikleri sınırlıdır (4,5). Bununla birlikte deneysel amaçla oluşturulan vaskülarizasyonlar üzerinde çeşitli moleküllerin etkisi olduğu bilinmektedir (1,2,3,4,5,6). Ancak bu ilaçların klinik kullanımları istenen düzeyde etki göstermemektedir. Bu nedenle insanlarda çeşitli sebeplerle oluşmuş KN üzerinde etkili medikal bir tedavinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır.

Son yıllarda Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEBF) inhibitörleri retina ve koroideadaki neovaskülarizasyonlarinin tedavisinde yaygın şekilde kullanılmaya başlanmıştır (7,8). Bu ilaçlardan bevacizumab, VEBF’nin tüm izoformlarini, pegaptanib sodyum ise sadece VEBF165’i inhibe etmektedir. çeşitli vaka serilerinde KN üzerinde bevacizumabin etkili olabileceği bildirilmiştir (9,10). Ancak literatürde pegaptanib sodyumun KN üzerine olan etkisini inceleyen sınırlı sayıda kaynak bulunmaktadır (11). çalışmamızda kobaylarda oluşturulan deneysel KN modelinde subkonjonktival bevacizumab ve pegaptanib sodyum enjeksiyonlarinin etkinliklerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.

GEREÇ ve YÖNTEM

Çalışmamız hastanemizde bulunan Araştırma ve Geliştirme Merkezi Akademi Bilimsel Kurulu ve Hayvan Deneyleri Etik Kurul Baskanliklari’nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvanlar ayrı kafesler içerisinde ve standart koşullar altında tutulmuştur.

400-450 gram arasında değişen toplam 21 kobay, yedişer hayvandan oluşan 3 gruba ayrıldı. Kimyasal kornea koterizasyonunu takiben subkonjonktival olarak birinci gruba (kontrol grubu) 0.1 ml dengeli tuz solüsyonu, ikinci gruba 0.1 ml’de 1 mg bevacizumab (Altuzan flakon;Roche, Genentech İnç, San Francisco, ABD), üçüncü gruba ise 0.1 ml’de 0.15 mg pegaptanib sodyum (Macugen;Pfizer, Gilead Sciences İnç, CA, ABD) enjeksiyonları gerçekleştirildi.

Tüm işlemler intraperitoneal 120 mg/kg ketamin hidroklorid (Ketalar; Eczacıbaşı, Türkiye) ve 20 mg/kg xylazine (Rompun; Bayer, Türkiye) kombinasyonu ile sağlanan genel anestezi ve topikal %0.5 proparakain hidroklorid (Alcaine; Alcon, Fort Worth, Texas-ABD), damlatildiktan sonra uygulandı. Anesteziyi takiben tüm hayvanların sağ gözlerinde kornea merkezi gümüş nitrat çubukları ile kimyasal olarak koterize edildi. Gümüş nitrat çubukları %75 gümüş nitrat ve %25 potasyum nitrat içermekteydi (HemoStop; Hizmet Medikal, Istanbul, Türkiye). Çubuklar tüm hayvanlarda 8 saniye süre ile kornea santraline bastırıldı (Resim-1a). Koterizasyondan sonra artık kimyasalların ortamdan uzaklaştırılması için kornea ve forniksler bol miktarda dengeli tuz solüsyonu ile temizlendi (Resim-1b). Ardından subkonjonktival enjeksiyonlar limbusun 1-2 mm gerisinden superior bulber konjonktivaya 29 gauge ucu olan 1 ml’lik tüberkülin enjektörleri ile yapıldı (Resim-1c). Tüm işlemler aynı araştırmacı (VH) tarafından gerçekleştirildi.

Hayvanlar kimyasal koterizasyondan sonra 10. Gün biyomikroskop ile muayene edildi ve dijital fotoğraf makinası ile fotoğrafları çekildi (Resim-1d). Her göz için yanık ve neovaskülarizasyon dereceleri Mahoney ve Waterbury (2) tarafından tanımlandığı şekilde belirlendi. Yanık skorları, oluşan yanigin kabarikligina göre 0 (kornea yüzeyinde kabarma yok), +1 (kornea yüzeyinden hafif kabaran küçük yanık), +2 (kornea yüzeyinden orta derecede kabarmış yanık), +3 (kornea yüzeyinde büyük kabarıklık) şeklinde derecelendirildi. Kornea neovaskülarizasyonlari yanık çevresinde, kornea yüzeyinde ve limbusta bulunan kızarıklık derecesine göre 0 ile +6 arasında derecelendirildi. Dijital fotoğraflar üzerinde Adobe Photoshop programı kullanılarak korneadaki yanık alanı ve neovaskülarizasyonun toplam kornea yüzey alanında kapladığı kısımlar yüzde şeklinde hesaplandı.

Ardından hayvanlar yüksek doz pentobarbital (Pentotal; Abbott, ABD) ile sakrifiye edildi. Gözler %10’luk formol içerisinde 24 saat bekletilerek fikse edildi ve histolojik olarak incelendi. Hematoksilen-eosin ile boyanan kesitler çalışma gruplarını bilmeyen bir araştırmacı tarafından (BK) incelendi. Işık mikroskopu ile büyük büyütmede (x400) kornea dokusu içerisinde en fazla vaskülarizasyon bulunan alandaki damar sayısı sayıldı (12). Grupları bilmeyen bir başka araştırmacı tarafından dijital fotoğraflar üzerinde Adobe Photoshop 5.5 kullanılarak piksel cinsinden yanık ve neovaskülarizasyon alanları ölçüldü (OD). Korneadaki yanigin ve neovaskülarizasyonun toplam kornea yüzey alanı içerisinde kapladığı alan yüzde olarak belirlendi (Neovaskülarizasyon alanı X 100 / toplam kornea alanı).Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. Gruplar arasındaki farklılıklar Kruskal-Wallis ve Bonferroni düzeltmeli Mann-Whitney U testleri ile incelendi. p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

SONUÇLAR

Çalışmamızda elde ettiğimiz veriler Tablo-1’de belirtilmiştir. Kornealarda oluşan yanık skorları açısından üç grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p=0.173). En yüksek yanık skoru pegaptanib grubunda belirlenmiştir (Resim-2). Neovaskülarizasyon skorları açısından üç grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır (p=0.082). Neovaskülarizasyon skorları arasında en yüksek değer kontrol grubunda belirlenmiştir. En az neovaskülarizasyon skoru ise Bevacizumab grubunda elde edilmiştir (Resim-2).

Kimyasal yanigin kornea yüzeyinde kapladığı alan açısından gruplar arasında anlamlı fark bulunmamaktaydi (p=0.101) (Resim-3). Neovaskülarizasyonun kornea yüzeyinde kapladığı alan ise gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı şekilde farklı bulunmuştur (p=0.001). En az neovaskülarizasyon alanı Bevacizumab grubunda tespit edilmiştir. Bevacizumab grubu ile kontrol grubu arasında (p=0.004) ve Bevacizumab grubu ile Pegaptanib grubu arasındaki fark (p=0.001) istatistiksel olarak anlamlıydı. Histolojik değerlendirme ile kornea içerisinde tespit edilen damar sayısı açısından gruplar arasında bulunan fark istatistiksel olarak sınırda anlamsız bulunmuştur (p=0.052). Histolojik kesitlerde damarlanma en az bevacizumab grubunda (8.86 ± 2.89), en fazla kontrol grubunda (13.05 ± 3.21) belirlenmiştir (Resim-3).

TARTIŞMA

Bevacizumabin KN üzerine olan etkisi ilk olarak Manzano (6) tarafından incelenmiştir. Bu çalışmada farelerde topikal uygulanan bevacizumabin kimyasal koterizasyon ile oluşturulan KN üzerinde etkili olduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde farelerde, tavşanlar ve kobaylarda yapılan farklı modellerde bevacizumabin özellikle KN oluşmadan önce uygulanması durumunda neovaskü- larizasyon gelişimini azaltan belirgin etkisi olduğu bilinmektedir (11,12,13). Ancak neovaskülarizasyonlar oluştuktan sonra bevacizumab uygulaması yapıldığında görülen etki azalmaktadır (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14).

çalışmamızda uyguladığımız deneysel KN modeli ilk olarak farelerde Mahoney tarafından (15) topikal ilaç etkinliğinin değerlendirmesi amacıyla uygulanmıştır. Kendi oluşturduğumuz modelde ise göz yapısı daha büyük olduğu için kobaylarda çalışmayı uygun gördük. Daha önce yaptığımız bir on çalışmada kobaylarda KN seviyesinin en üst düzeye koterizasyondan sonra 7-10 gün arasında çıktığını belirlemiştik. Bu nedenle ilaç etkinliği bu dönemde değerlendirilmiştir. Bununla birlikte ilaçların daha uzun süre etki göstermesi için topikal tedavi yerine subkonjonktival enjeksiyon uygulamayı tercih ettik.

Bevacizumabin kobaylarda KN üzerine etkili olduğu bildirilmiş olsa da pegaptanibin kobaylarda etkinliğini inceleyen herhangi bir çalışma bulunmamaktadır (1). Eyetech çalışma grubunun yaptığı Faz-1 çalışmasında (11) farelerde kornea stromasina yerleştirilen polimerler ile KN oluşturulmuştur. Bu modelde intravenöz pegaptanib sodyum ile KN’larinda %65 oranında gerileme sağlanmıştır. Bizim çalışmamızda subkonjonktival pegaptanib uygulanan grupta, korneadaki yanık skoru ve yanık alan yüzdesi kontrol grubundan daha yüksek olmasına rağmen histolojik olarak neovaskülarizasyon derecesi kontrol grubundan daha düşük olarak belirlenmiştir. Ancak pegaptanibin etkisi, uyguladığımız dozda bevacizumabin etkisinden daha azdı. Bevacizumab grubundaki KN derecesi pegaptanib ve kontrol gruplarına göre belirgin şekilde daha düşüktü.

Bevacizumabin insanlarda çeşitli sebeplerle oluşan KN’lari üzerinde etkili olabileceği bildirilmiştir (16). Ancak pegaptanibin benzer şekilde kullanımı ile ilgili çalışma bulunmamaktadır. çalışmamızda kullandığımız iki molekül de KN’lari azaltma amacıyla insanlarda kullanılma potansiyeline sahiptir, ancak fiyat avantajı nedeniyle bevacizumab üzerinde daha çok çalışma yapılmaktadır. Bununla birlikte oküler uygulamalarda sistemik kullanımına göre çok düşük dozda kullanılmasına rağmen bevacizumabin hayatı tehdit eden ciddi sistemik yan etki gösterebileceği bildirilmektedir (17). Pegaptanib ise pahalı bir ilaç olduğundan koroidea neovaskülarizasyonlari haricinde kullanımı sınırlıdır.

çalışmamızda bevacizumab ve pegaptanib sodyumun sadece tek dozdaki etkinliği incelenmiştir. Bu husus bir eksiklik olarak kabul edilebilir. Ancak uyguladığımız dozda her iki molekülün de belirli seviyede KN üzerinde azaltıcı etki gösterdiğini gözlemledik. Bevacizumab pegaptanib’den daha etkili gözükse de, pegaptanib’in daha yüksek dozda kullanımı ile bu etkinin artacağı düşüncesindeyiz. Elde ettiğimiz sonuçlar değerlendirilirken unutulmaması gereken önemli bir nokta hayvan çalışmalarında elde edilen sonuçların insanlarda elde edilecek klinik etkinliği tam gösterememesidir. Insan korneasinda kullanılacak etkili VEBF inhibitör dozu bu nedenle uyguladığımız dozdan çok daha düşük ya da fazla olabilir. Bu husus ileriki dönemde yapılacak çalışmalarla aydınlatılacaktır.

Sonuç olarak çalışmamızda kobaylarda kimyasal koterizasyon ile oluşturulan KN modelinde, subkonjonktival bevacizumab ve pegaptanib sodyum enjeksiyonu neovaskülarizasyon gelişimini azaltacak şekilde etkili bulunmuştur. Klinik uygulamada iki molekülün gerçek değerinin ortaya konulması için ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.